Summary

L'espressione di proteine ​​fluorescenti in<em> Branchiostoma lanceolatum</em> By mRNA iniezione in ovociti non fecondate

Published: January 12, 2015
doi:

Summary

Riportiamo qui l'espressione robusto ed efficiente di proteine ​​fluorescenti dopo l'iniezione di mRNA in oociti fecondati di Branchiostoma lanceolatum. Lo sviluppo della tecnica microiniezione in questo chordate basale aprirà la strada di una profonda innovazioni tecniche in questo sistema modello emergente, tra cui imaging in vivo e manipolazioni gene-specifici.

Abstract

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Introduction

Durante lo sviluppo, una singola cellula dà origine ad un intero organismo in un processo altamente complesso che coinvolge entrambi divisioni e movimenti delle cellule. Per comprendere meglio i principi biologici alla base delle dinamiche del comportamento delle cellule, i biologi dello sviluppo hanno iniziato ad utilizzare in tecniche di imaging in vivo basato sulla fluorescenza. Compartimenti specifici di cellule, come le membrane cellulari, possono sia essere etichettati da trattamenti con coloranti fluorescenti, un approccio ostacolato dalla mancanza di specificità e di penetrazione del tessuto 1, o dall'introduzione specifica negli embrioni di mRNA esogeni codificanti proteine ​​fluorescenti 2. Diverse tecniche possono essere utilizzate per l'erogazione efficace dei composti esogeni, quali mRNA. Questi includono, ma non sono limitati a, microiniezione, elettroporazione, bombardamenti con microparticelle, lipofezione e trasduzione 3,4. Sebbene tutti questi approcci possono essere utilizzati per introdurre composti esogeni in unsviluppo dell'embrione, solo microiniezione consente l'applicazione di quantità predefinite e precisi in ogni cella 3. Tecniche di microiniezione sono stati descritti per tutti i principali sistemi di modelli di sviluppo 4 (ad esempio, i moscerini della frutta, vermi nematodi, zebrafish, rane, topi), oltre che per alcuni modelli alternativi di 4, compresi quelli utilizzati per gli studi comparativi volti a comprendere l'evoluzione dei meccanismi di sviluppo (ad esempio, anemoni di mare, vermi anellidi, ricci di mare, tunicati ascidie, l'anfiosso Cephalochordata).

Cephalochordates, che insieme con i tunicati e vertebrati stabiliscono il phylum cordati, particolarmente modelli adatto per studiare l'evoluzione dei Cordati e la diversificazione dei vertebrati da un antenato invertebrato 5-8. Il lignaggio Cephalochordata discostato molto presto durante l'evoluzione dei cordati; e cephalochordates esistenti, che si suddividono in tre generi (Branchiostoma, Asymmetron e Epigonichthys), assomigliano vertebrati sia in termini di anatomia generale e l'architettura del genoma 5-8. Delle circa 30 specie di cephalochordates che sono stati descritti finora, cinque sono disponibili per gli studi embriologici e sviluppo 6,9: Asymmetron lucayanum (il lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (l'anfiosso Florida), Branchiostoma lanceolatum (l'anfiosso europeo), Branchiostoma belcheri (l'anfiosso cinese) e Branchiostoma japonicum (l'anfiosso giapponese). Adulti maturi di tre di queste specie (B. lanceolatum, B. belcheri e B. japonicum) possono essere indotti a deporre le uova su richiesta durante la stagione riproduttiva 10,11. Inoltre, almeno per B. lanceolatum, la deposizione delle uova efficiente può anche essere indotta in acqua di mare artificiale 12, rendendo in tal modo questa particolare specie Cephalochordata accessibile per laboratorIES che non hanno accesso ad acqua di mare naturale. La combinazione, in B. lanceolatum, di un accesso comodo e affidabile per gli embrioni con un metodo di consegna efficiente, come ad esempio la microiniezione, finora l'unica tecnica di consegna sviluppata in anfiosso (sia in B. floridae e B. belcheri) 13-15, consentirà lo sviluppo di un romanzo suite di tecniche manipolative, tra cui lignaggio tracing- e approcci basati sul comportamento di cellule dinamica.

Un protocollo per la microiniezione di mRNA efficace per esprimere le proteine ​​fluorescenti in B. lanceolatum embrione è stato sviluppato di conseguenza. Inoltre, per fornire un kit di strumenti di base per l'imaging dal vivo di B. embrioni lanceolatum, sistemi di vettori sono stati sviluppati che permettono associata alla membrana ed espressione nucleare di proteine ​​fluorescenti. Per membrane targeting, maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) è stato fuso con la casella CAAX umana HRAS e localizzazione nucleare di mCherry e eGFP eraottenute per fusione alla esone zebrafish istone 2B (H2B) (Figura 1, File supplementare 1). Inoltre, con lo scopo di ottimizzare la traduzione della proteina, le sequenze Kozak e codoni dei costrutti sono stati modificati e adattati all'uso in B. lanceolatum. Nel loro insieme, il metodo di iniezione e di espressione vettori qui presentati serviranno da base per la generazione di nuovi approcci sperimentali per cephalochordates, in particolare analisi utilizzando la più recente a fluorescenza a base di tecniche di imaging in vivo.

Protocol

1. Preparazione di strumenti e reagenti Trasferimento pipette Pasteur Generare una serie di pipette Pasteur transfer con diversi diametri di punta tirando 230 millimetri lunghi pipette Pasteur sopra una fiamma a velocità diverse. Assicurarsi che il cono è più a lungo possibile per un controllo più fini di aspirazione. Con un scrivano diamante, graffiare la pipetta lungo una linea perpendicolare alla lunghezza della pipetta. Con entrambe le mani estrarre la pip…

Representative Results

Il protocollo descritto sopra fornisce la base per la microiniezione di B. ovociti lanceolatum e quindi per l'introduzione nella sviluppare B. embrioni lanceolatum di mRNA che codificano proteine ​​fluorescenti per l'imaging in vivo. Sebbene la tecnica è certamente robusto ed affidabile, il tasso di successo di iniezioni utilizzando questo protocollo rimane variabile (Tabella 1). La spiegazione molto probabile per questo fatto interessante è l&#…

Discussion

In questo articolo, presentiamo, per la prima volta, un protocollo dettagliato e riproducibile per l'iniezione di B. ovociti lanceolatum, che, dopo il B. floridae 13,14 e B. belcheri 15, è quindi la terza specie anfiosso, per cui tale tecnica è stata descritta. È importante sottolineare che il protocollo qui descritto comprende inoltre la descrizione di sistemi vettore adatto per la produzione di proteine ​​fluorescenti in B. lanceolatum da mR…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno da parte del "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" per la zootecnia. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi da ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 e ANR-11-JSV2-002-01) a Michael Schubert, dalla sovvenzione dell'Unione Europea FP6 "Embryomics" e dalla concessione ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process "di Jean-François Nicolas e Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho è finanziato da una borsa di studio di dottorato FCT (SFRH / BD / 86878/2012).

Le richieste di vettori qui descritte possono essere indirizzate direttamente agli autori.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Consumables
35 mm Petri dishes Falcon 353001 culture-treated
Filtration unit (Stericup 1L) Fisher W21719 0.22 micron filtration
Spin-X tubes Costar 8160 0.22 micron filtration tube
Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries WPI E212
Pasteur Pipettes 230 mm long
Aspiration tube Dutscher 75056
Capillaries for injection needles Sutter BF 120-94-10 Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm
Reagents
Low-melting agarose SIGMA A9414
Phenol Red SIGMA 114537
Glycerol SIGMA G2025
Poly-L-Lysine hydrobromide SIGMA P9155
H2O Dnase, Rnase-free Gibco 10977-035
mMessage mMachine SP6 Transcription kit Ambion AM1340 mRNA synthesis kit
Phenol pH8 SIGMA P4557
24:1 chloroform:isoamylic alcohol SIGMA C0549
5:1 phenol pH4.7:chloroform SIGMA P1944
Reef Crystal salts (200 kg) Europrix  Commercial salts
Equipment
Fluorescent dissecting scope with 200x magnification  Leica MZ16F 25x oculars, DSR and GFP2 filters
Micromanipulator Marzhauzer M-33
Injector Picospritzer model II or III
Needle puller Sutter P97 heating-filament needle puller
Fine forceps FINE SCIENCE TOOLS GMBH 11252-30 Dumont #5

References

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Hirsinger, E., Carvalho, J. E., Chevalier, C., Lutfalla, G., Nicolas, J., Peyriéras, N., Schubert, M. Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes. J. Vis. Exp. (95), e52042, doi:10.3791/52042 (2015).

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