Expressão de proteínas fluorescentes em<em> Branchiostoma lanceolatum</em> Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados
Summary
Relatamos aqui a expressão robusta e eficiente de proteínas fluorescentes após a injeção de mRNA em oócitos não fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. O desenvolvimento da técnica de microinjeção neste cordados basal irá pavimentar o caminho para longo alcance inovações técnicas neste sistema modelo emergente, incluindo in vivo de imagens e manipulações específicas de genes.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
Durante o desenvolvimento, uma única célula dá origem a um organismo inteiro num processo altamente complexo que envolve ambos os movimentos e divisões celulares. Para melhor compreender os princípios biológicos subjacentes a dinâmica do comportamento celular, os biólogos do desenvolvimento começaram a usar em técnicas de imagem vivo à base de fluorescência. Compartimentos específicos de células, como as membranas celulares, ou podem ser marcados por meio de tratamentos com corantes fluorescentes, uma abordagem dificultada por uma falta de especificidade e de penetração no tecido 1, ou pela introdução específica para o embrião de mRNAs exógenos que codificam proteínas fluorescentes 2. Técnicas diferentes podem ser usadas para a entrega eficiente de substâncias exógenas, tais como ARNm. Estes incluem, mas não se limitam a, microinjecção, electroporação, bombardeamento com micropartículas, lipofecção e transdução de 3,4. Apesar de todas estas abordagens podem ser utilizadas para introduzir compostos exógeno numadesenvolvimento do embrião, só microinjeção permite a aplicação de quantidades pré-definidas e precisas em cada célula 3. Técnicas de microinjeção foram descritas para todos os principais sistemas modelo de desenvolvimento 4 (por exemplo, moscas de frutas, vermes nematóides, peixe-zebra, sapos, ratos), bem como para alguns modelos alternativos 4, incluindo aqueles usados para estudos comparativos que visam a compreensão da evolução dos mecanismos de desenvolvimento (por exemplo, anêmonas do mar, vermes anelídeos, ouriços do mar, tunicados de ascídias, o anfioxo cephalochordate).
Cephalochordates que, juntamente com tunicados e vertebrados estabelecer o filo dos cordados, particularmente modelos bem adequado para estudar a evolução de cordados e da diversificação de vertebrados de um ancestral invertebrado 5-8. A linhagem cephalochordate divergiram muito cedo durante a evolução cordados; e cephalochordates existentes, que são subdivididas em três gêneros (Branchiostoma, Asymmetron e Epigonichthys), se assemelham vertebrados tanto em termos de anatomia geral e arquitetura do genoma 5-8. Dos cerca de 30 espécies de cephalochordates que foram descritas até agora, cinco estão disponíveis para estudos de embriologia e desenvolvimento: 6,9 Asymmetron lucayanum (o lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (o anfioxo Florida), Branchiostoma lanceolatum (o anfioxo Europeia), Branchiostoma belcheri (o anfioxo chinês) e Branchiostoma japonicum (o anfioxo japonês). Adultos maduros de três destas espécies (B. lanceolatum, B. belcheri e B. japonicum) podem ser induzidas a desovar sob demanda durante a época de reprodução 10,11. Além disso, pelo menos para B. lanceolatum, desova eficiente pode também ser induzida em água do mar artificial 12, tornando esta espécie cephalochordate particulares acessível para laborators que não têm acesso à água do mar natural. A combinação, em B. lanceolatum, de um acesso conveniente e confiável para embriões com um método de entrega eficiente, como a microinjeção, até agora a única técnica de entrega desenvolvido em anfioxo (em ambos B. floridae e B. belcheri) 13-15, permitirá o desenvolvimento de um novela conjunto de técnicas de manipulação, incluindo tracing- linhagem e abordagens baseadas em comportamento de células dinâmica.
Um protocolo para a microinjecção eficiente de ARNm para expressar as proteínas fluorescentes na B. lanceolatum embrião foi, portanto desenvolvido. Além disso, para fornecer um conjunto de ferramentas de base para geração de imagens ao vivo de B. embriões lanceolatum, foram desenvolvidos sistemas de vectores que permitem a associada à membrana e expressão nuclear de proteínas fluorescentes. Para segmentação membrana, maior proteína verde fluorescente (eGFP) foi fundido com a caixa CAAX humano HRAS e localização nuclear de mCherry e eGFP foiobtido por fusão para o peixe-zebra exão histona 2B (H2B) (Figura 1, complementar do ficheiro 1). Além disso, com o objectivo de optimizar a tradução da proteína, as sequências Kozak e codões das construções tenham sido modificados e adaptados para uso em B. lanceolatum. Tomados em conjunto, o método de injecção e vectores de expressão aqui apresentados servem como uma base para a geração de novas abordagens experimentais para cephalochordates, nomeadamente as análises usando o mais recente de fluorescência com base em técnicas de imagiologia in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, apresenta-se, pela primeira vez, um protocolo detalhado e reprodutível para a injecção de B. oócitos lanceolatum, que, depois de B. floridae 13,14 e B. belcheri 15, é, assim, a terceira espécie anfioxo, para que uma tal técnica tem sido descritas. É importante notar que o protocolo aqui descrito também inclui a descrição de sistemas de vectores adequados para a produção de proteínas fluorescentes em B. lanceolatum injectados a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o apoio da "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" para criação de animais. Este trabalho foi financiado por fundos da ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 e ANR-11-JSV2-002-01) para Michael Schubert, pela concessão União Europeia FP6 "Embryomics" e pela concessão ANR "ANR- 10 BLAN-121801 Dev-Process "para Jean-François Nicolas e Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho é financiado por uma bolsa de doutoramento da FCT (SFRH / BD / 86878/2012).
Os pedidos de vectores descritos aqui podem ser enviadas diretamente para os autores.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
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