Uttryck av fluorescerande proteiner i<em> Lansettfisk</em> Av mRNA Injektion i Obefruktade Oocyter
Summary
Vi rapporterar här robusta och effektiva uttryck av fluorescerande proteiner efter mRNA injektion i obefruktade oocyter av Lansettfisk. Utvecklingen av mikroinjektion tekniken i denna basala chordate kommer att bana väg för långtgående tekniska innovationer inom detta framväxande modellsystem, inklusive in vivo imaging och genspecifika manipulationer.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
Under utveckling, ger en enda cell upphov till en hel organism i en mycket komplex process som involverar både celldelningar och rörelser. För att bättre förstå de biologiska principer dynamiken i cellens beteende, har utvecklingsbiologer börjat använda fluorescens-baserade in vivo avbildningstekniker. Specifika facken i celler, såsom cellmembran, kan antingen märkas av behandlingar med fluorescerande färger, ett tillvägagångssätt hämmas av brist på specificitet och vävnadspenetration 1, eller av den specifika införande i embryot av exogena mRNA kodar fluorescerande proteiner 2. Olika tekniker kan användas för effektiv leverans av exogena föreningar, såsom mRNA. Dessa innefattar, men är inte begränsade till, mikroinjektion, elektroporering, bombardemang med mikropartiklar, lipofektion och transduktion 3,4. Även om alla dessa metoder kan användas för att införa exogena föreningar till enväxande embryot, bara mikroinjektion tillåter tillämpningen av fördefinierade och exakta mängder i varje cell 3. Mikroinjektion tekniker har beskrivits för alla större utvecklingsmodellsystem 4 (t.ex. fruktflugor, nematod maskar, zebrafisk, grodor, möss) såväl som för några alternativa modeller 4, inklusive de som används för jämförande studier som syftar till att förstå utvecklingen av utvecklingsmekanismer (t.ex. havsanemoner, Annelid maskar, sjöborrar, ascidian manteldjur, den Lansettfiskar amphioxus).
Cephalochordates, som tillsammans med manteldjur och ryggradsdjur fastställer chordate fylum, är särskilt väl lämpade modeller för att studera utvecklingen av chordates och diversifieringen av ryggradsdjur från en ryggradslös förfader 5-8. Den Lansettfiskar härstamning avvek mycket tidigt under chordate evolution; och ännu existerande cephalochordates, som indelas i tre släkten (Branchiostoma, Asymmetron och Epigonichthys), liknar ryggradsdjur både vad gäller övergripande anatomi och genomet arkitektur 5-8. Av de cirka 30 arter av cephalochordates som har beskrivits hittills, fem är tillgängliga för embryologiska och utvecklingsstudier 6,9: Asymmetron lucayanum (Bahama LANSETTFISK), Branchiostoma floridae (Florida amphioxus), Lansettfisk (den europeiska amphioxus), Branchiostoma belcheri (den kinesiska amphioxus) och Branchiostoma japonicum (den japanska amphioxus). Mogna vuxna i tre av dessa arter (B. lanceolatum, B. belcheri och B. japonicum) kan förmås att leka on-demand under häckningssäsongen 10,11. Dessutom, åtminstone för B. lanceolatum, kan effektiv lek också induceras i artificiellt havsvatten 12, vilket gör detta särskilt Lansettfiskar arter tillgänglig för labotalet som inte har tillgång till naturligt havsvatten. Kombinationen, i B. lanceolatum, en bekväm och pålitlig tillgång till embryon med en effektiv leveransmetod, såsom mikroinjektion, hittills den enda leverans teknik utvecklad i amphioxus (i både B. floridae och B. belcheri) 13-15, kommer att möjliggöra utvecklingen av en roman svit av manipulativa tekniker, bland annat härstamning tracing- och dynamisk cellbeteendebaserade strategier.
Ett protokoll för effektiv mikroinjektion av mRNA för att uttrycka fluorescerande proteiner i B. lanceolatum embryo följaktligen utvecklats. Dessutom, för att ge en grundläggande verktygslåda för live avbildning av B. lanceolatum embryon undersöktes vektorsystem utvecklats som tillåter membranassocierat och nukleär expression av fluorescerande proteiner. För membraninriktning förhöjdes grönt fluorescerande protein (EGFP) fusionerad till den humana HRAS CAAX boxen och nukleär lokalisering av mCherry och EGFP varerhålls genom sammansmältning till zebrafisk histon 2B (H2B) exon (Figur 1, Kompletterande Arkiv 1). Dessutom med målet att optimera protein översättning, de Kozak-sekvenser och kodon av konstruktionerna har modifierats och anpassats till användning i B. lanceolatum. Sammantaget kommer den injektionsteknik och expressionsvektorer presenteras här tjäna som underlag för generering av nya experimentella metoder för cephalochordates, särskilt analyser använder den senaste fluorescens-baserade in vivo avbildningstekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln presenterar vi, för första gången, en detaljerad och reproducerbar protokoll för injektion av B. lanceolatum oocyter, som efter B. floridae 13,14 och B. belcheri 15, är alltså den tredje amphioxus arter, för vilka en sådan teknik har beskrivits. Viktigt beskrev protokollet här innefattar även beskrivningen av vektorsystem lämpat för produktion av fluorescerande proteiner i B. lanceolatum från injicerade mRNA som producerats in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för det stöd som "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" för djurhållning. Detta arbete stöddes av medel från ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 och ANR-11-JSV2-002-01) till Michael Schubert, av Europeiska unionen FP6 bidrag "Embryomics" och av ANR bidraget "ANR- 10-BLAN-121.801 Dev-Process "till Jean-François Nicolas och Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho finansieras genom en FCT doktorandstipendium (SFRH / BD / 86878/2012).
Begäran om vektor beskrivs här kan ställas direkt till författarna.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
