Teknik af porcin Liver Indkøb og ortotopisk Transplantation ved hjælp af en Active Porto-Caval Shunt

Summary

Experimental animal research plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. The porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) closely resembles human conditions and is frequently used in clinically oriented research. The following protocol contains all information for a reliable porcine OLTx model using an active porto-caval-jugular shunt.

Abstract

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation waiting list die without receiving an organ transplant or are delisted due to disease progression. Even after a successful transplantation, rejection and side effects of immunosuppression remain major concerns for graft survival and patient morbidity.

Experimental animal research has been essential to the success of liver transplantation and still plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. In particular, the porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) is optimal for clinically oriented research for its close resemblance to human size, anatomy, and physiology.

Decompression of intestinal congestion during the anhepatic phase of porcine OLTx is important to guarantee reliable animal survival. The use of an active porto-caval-jugular shunt achieves excellent intestinal decompression. The system can be used for short-term as well as long-term survival experiments. The following protocol contains all technical information for a stable and reproducible liver transplantation model in pigs including post-operative animal care.

Introduction

Ortotopisk levertransplantation (OLTx) er den eneste behandlingsmulighed for patienter med slutstadiet leversygdom eller avanceret hepatocellulært carcinom. For de sidste 25 år er antallet af ansøgere på ventelisten gradvist øget, og nu langt overstiger antallet af tilgængelige podninger. I de fleste transplanterede regioner, 20 til 30% af patienterne på ventelisten til levertransplantation dø uden at modtage en organtransplantation eller afnoteret pga progression af sygdommen. Strategier til at øge donorpuljen og dermed antallet af tilgængelige transplantater, desperat påkrævet. Udvidede tildelingskriterier orgel, langvarig graft konservering, og induktion af immunologisk tolerance stadig udgør store kliniske udfordringer ^1-3. Derfor eksperimentel OLTx forskning er afgørende for at optimere kliniske OLTx praksis.

Porcin OLTx er en veletableret forsøgsmodel, der ligner humant OLTx på mange måder, herunder lIver størrelse, anatomi og fysiologi ^4-6. Således er det blevet en standard eksperimentel metode forskningsfelter såsom kirurgiske teknikker, fysiologi, immunologi, konservering og iskæmi-reperfusion skade. Talrige teknikker til graft indkøb, modtager hepatektomi, og især vaskulær rekonstruktion, er blevet beskrevet i litteraturen ^5. Valget af den passende teknik varierer efter forskerens præference og tekniske formåen.

I modsætning til den humane scenario, splanknisk trafikbelastning i den anhepatic fase er et vigtigt problem i porcin OLTx. Efterfølgende intestinal iskæmi og kongestiv vaskulær skade kan forårsage alvorlig hæmodynamisk ustabilitet, bringes i fare svin overlevelse og dermed succesen af forsøget ^7-9. Derfor tilstrækkelig tarm dekompression er obligatorisk, især i mindre teknisk raffineret eksperimentelle indstillinger.

Osing en aktiv porto-Caval-jugularis shunt for varigheden af ​​den anhepatic fase er en pålidelig mulighed for at undgå tarm overbelastning. Systemet kan anvendes til tidlig reperfusion eksperimenter såvel som langsigtede overlevelse scenarier. Følgende protokol indeholder alle oplysninger for en stabil og reproducerbar levertransplantation model hos svin, herunder donor liver indkøb, modtager drift herunder hepatektomi og end-to-end fartøj genopbygning teknikker, og postoperativ pleje.

Protocol

Alle dyr fik human måde i overensstemmelse med de '' Principles of Laboratory Animal Care '' formuleret af den nationale Society for Medical Research og '' Guide til pleje af forsøgsdyr '' udgivet af National Institutes of Health, Ontario, Canada . Animal Care Komité Toronto General Research Institute godkendt alle undersøgelser. 1. Organ Retrieval House mandlige Yorkshire grise mellem 30 og 35 kg i forskningscenter i 1 uge før transplantation for at forhindre en stress-induceret fysisk reaktion (som kan ændre perfusionen udfald 10,11), og at akklimatisere dyrene til boligforhold. Fast grisen i mindst 6 timer før induktion af anæstesi. Anesthetize donorgris ved en intramuskulær (im) injektion af en blanding af ketamin (25 mg / kg), atropin (0,04 mg / kg), og midazolam (0,15 mg / kg). </li> Forud for intubation, sikre grisen spontant ånder 2 L af ilt doseret med 5% af isofluran. I liggende stilling, spray stemmebåndene med 2% lidocain 2 min før intubation at undgå vokal snor spasmer. For en 35 kg gris, bruge en 6,5 Fr trachealtube. Blokere luftrørsslangen med 3-5 ml rumluft. Efter intubation, brug capnometry at bekræfte korrekt intubation. Overvåg puls og iltmætning ved pulsoximetri på grisens hale. Sænk isofluran fordamperen til 2%. Justere dybden af ​​anæstesi ved minimal alveolær koncentration (MAC) værdier; sigte efter 2-2,5 MAC. Indstille ventilatoren til 14-16 vejrtrækninger / min og et respirationsvolumen på 10 – 15 ml / kg legemsvægt. Placer en 18 G intravenøs (iv) kateter i en af ​​de ørevener at tillade infusion af Ringers lactat (200 ml / time). Skrub grisen og dække det med sterile forhæng. Efter at have sikret sterile forhold, lave en midterlinjen laparotomi følgenwed af en venstre sideværts forlængelse. Brug et håndklæde til at dække store og små tarme, før du flytter dem til venstre side. Opdele falciforme ligament og det trekantede ligament ved hjælp af en cautery. Slip leveren fra mellemgulvet på højre side ved hjælp af en elektro-cautery; bruge en saks til den øvre del mellem cava og mellemgulv. Dissekere infrahepatic cava ned til gren af ​​adrenal vene i højre side, og den renale vene i venstre side. Adskil infrahepatic cava og distale aorta fra hinanden; ligere aorta grene til rygsøjlen; isolere og gratis renale arterier fra vedhængende væv. Surround hver nyrearterien med en 2-0 uafgjort. Craniale til venstre renale vene, dissekere aorta og mesenteriske arterie. Surround den mesenterialarterie med en 2-0 uafgjort. Efter åbning af bughinden kranie til mesenterialarterie, omhyggeligt følge aorta mod cøliaki stammen. Dissekere cøliaki stammen kaudalt til portalen vei; omgiver milt og venstre gastrisk arterier, som gren posteriort fra cøliaki stammen. Dissekere cøliaki stammen fra portalen vene. Slip portalen vene af en peritoneal snit mellem bugspytkirtlen og portal vene. Bind off vener afløb fra bugspytkirtlen til portalen vene. Adskil galdegang fra hepatoduodenal ledbånd og deler det distalt efter ligering. Ligere lymfekar i hepatoduodenal ligament at forhindre lymfatisk lækage. Opdel den gastroduodenale arterie og højre gastriske arterier mellem bånd. Ligere mindre vener. Dissekere aorta bag membranen mellem hjertet og cøliaki stammen. Placer en 2-0 uafgjort omkring aorta kranie til cøliaki stammen. Fjern galdeblæren og ætse nogen blødning fra galdeblæren sengen. Åbne op mellemgulvet. Administrere 1.000 IE / kg donor vægt af heparin intracardialt eller iv Indstil isofluran til 5% (> 2,5 MAC) for at opnåen dybere anæstesi niveau. For en donor efter kredsløbssygdomme død (DCD) model, inducerer hjertestop ved intracardial injektion af 40 mval KCI 3 min efter heparin administration. Sæt hjertestop som udgangspunkt varm iskæmi. Bind off de tidligere fastsatte bånd rundt om nyre-, milt, mesenterial, og venstre gastrisk arterier. Bind off aorta distalt mellem nyre- og iliaca arterier og kanyle aorta med et organ flush linje. Bind off portalen vene så proksimalt som muligt og kanyle det med et andet organ flush linje. Efter lukning af forudindstillede slips omkring den proksimale aorta, skylle leveren med 2 l kold University of Wisconsin (UW) løsning ved hjælp dobbelt perfusion via aorta (tryk pose) og portal vene (tyngdekraft-drevet). Udskære leveren, efterlader alle resterende fartøjer lang. Efterlad en generøs diafragma rand omkring suprahepatic cava. Placer leveren i en steril orgel pose på is. Under back-table forberedelse, clAMP suprahepatic cava under anvendelse af en Satinsky klemme og skylle leveren endnu en gang med ca. 0,5 L fra UW opløsning retrogradt via den nedre vena cava inferior indtil portvenen udstrømning er klar. Binde off alle arterielle grene af aorta og cøliaki stammen. Udfør en arteriel back-table tryk perfusion med de resterende 0,5 liter UW løsning 12. Skyl galdegang hjælp UW løsning. Trimme diafragma patch til en anstændig størrelse. Luk alle phrenic vener – som regel 3, 1 hver til venstre og højre, og 1 posterior – ved hjælp af 4-0 monofilament polypropylen sting. Luk orgel pose og opbevar leveren på is. 2. Modtager hepatektomi Bedøver modtageren gris med en im injektion af en blanding af ketamin (25 mg / kg), atropin (0,04 mg / kg), og midazolam (0,15 mg / kg). Placer gris i rygleje på et kirurgisk bord oven på en varmemåtte. Dæk grisen with en varme-cirkulerende tæppe. Forud for intubation, sikre grisen spontant ånder 2 L af ilt doseret med 5% af isofluran. Spray stemmebåndene med 2% lidocain 2 min før intubation at undgå vokal snor spasmer. For en 35 kg gris, bruge en 6,5 Fr trachealtube. Blokere luftrørsslangen med 3-5 ml rumluft. Efter intubation, brug capnometry at bekræfte korrekt intubation. Overvåg puls og iltmætning ved pulsoximetri på grisens hale. Placer og fastsætte en temperatur sonde ind i grisens tryne. Sænk isofluran fordamper til 2% (sigte mod 2-2,5 MAC). Indstille ventilatoren til 14-16 vejrtrækninger / min og et respirationsvolumen på 10 – 15 ml / kg legemsvægt. Bruge salve på øjne at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Brug Seldinger-teknik 13 for at indsætte en kappe inducer (8,5 Fr) i den venstre ydre halsvene. Brug denne kateter senere for en aktiv portal-Caval-jugularis bypass. Brug Seldinger technique at indsætte en total parenteral ernæring (TPN) kateter (9,5 Fr) i den højre eksterne halsvene. Under sterile forhold, dissekere den højre carotidarterie og indsætte et polypropylen kateter (18 G) for invasiv arterietryk overvågning. Omgiv arterien med en 2-0 silkeslips til at tillade nødhjælp ligation. Skrue ned for isofluran fordamperen til 1% (1,5-2 MAC) og tilsæt propofol (5 – 8 mg / kg / time iv) at opretholde dybde af anæstesi. For analgesi, anvende kontinuerlig iv infusion af fentanylcitrat (mest foretrukket, 2 ug / kg / time) eller remifentanil (andet valg, 15 ug / kg / time). Før incision i huden, giver 1.000 mg cefuroxim og 500 mg metronidazol iv. Oprettet en infusionspumpe hjælp Ringer laktat med 5% glucose ved 150 ml / time. Placer varme-cirkulerende tæppe på hovedet og halsområdet. Skrub grisen og dække det med sterile forhæng. Under sterile forhold, lave en midterlinjen laparotomi. Indsæt en abdominal retractor at få tilstrækkelig adgang til højre øvre kvadrant. Opdel falciforme ledbånd og trekantede ledbånd ved hjælp cautery. I flere trin, opdele hepatoduodenal ligament tæt på leveren mellem bånd. Identificere, dividere, og markere de grene af den hepatiske arterie og galdegang. Dissekere hepatiske arterie retrograd indtil opdelingen af ​​gastroduodenale arterie. Sikre, at en bulldog klemme passer omkring den fælles hepatisk arterie proksimalt for gastroduodenale arterie til senere fastspænding. Frigør portalen vene fra vedhængende væv. Mobilisere vena cava fra retroperitoneum på højre side ved hjælp af en elektro-cautery. Brug en saks til den øvre del mellem cava og mellemgulv. Dissekere infrahepatic cava ned til gren af ​​adrenal vene i højre side, og den renale vene i venstre side. Udsætte hilum af milten. Omtrent halvvejs langs milten længde, omhyggeligt fri aff milten arterie og vene fra klæbet peritoneale lag. Surround både milt arterie og vene med 4 2-0 silkeslips. Indsæt en 8,5 Fr kappe inducer med 2 ekstra huller i kateterets spids ind i milten vene, der peger distalt mod portalen vene. Fastgør kateteret distalt til dens indsættelse med en af ​​de 2-0 bånd og lukke venen proximalt til indsættelse med en anden 2-0 slips. Lad de andre 2 bånd åbne. Trække blod fra kateteret, skylle det med 10 ml saltopløsning, og lukke klemmen af ​​kateteret. Fyld saltvand ind i en bypass, der består af en centrifugalpumpe hoved, en jugularis rør (3/16 "), og indstrømning fra både en portal gren (3/16") og en Caval gren (1/4 ", Luer Lock stik på proksimal åbning). Sætte en slange klemme på den proksimale ende af Caval slange. Slut portalen og jugularis åbning af bypass både kappe Indføringshylstre katetre (figur 1), og forsegle ConneIndsatsen med en metal slangeklemme ring. Placer centrifugalpumpe hovedet i sin pumpe position. Giv 1.000 mg tranexamsyre og 10.000 IE heparin 3 min iv før cross-fastspænding. Reducer propofol infusionshastigheden til 2 mg / kg / time i tidspunktet for den anhepatic fase. Juster isofluran fusions det arterielle tryk og grisens reaktivitet. Åbn klemmerne på begge kappe Indføringshylstre katetre og cross-clamp portalen vene. Sørg for, at blodet løber gennem bypass passivt. Start centrifugalpumpen på omkring 1.500 runder / min. Fortsæt cross fastspænding hvis a) grisen er cardiovascularly stabil og b) bypass kører ved ca. 500 ml / min. Hvis grisen ikke tåler cross-fastspænding, stedfortræder volumen (krystalloider eller kolloider) og inotrop agenter (noradrenalin i små boli). Cross klemme den infrahepatic vena cava bare craniale til de renale vener bruger De Bakey-Beck klemme. Påfør et fast tryk på leveren tissue at presse en del af den rest blod. Cross-klemme den suprahepatic vena cava herunder et diafragma rand under anvendelse af en Satinsky klemme mens tilbagetrækning af leveren kaudalt. Skær suprahepatic vena cava direkte ved grænsen til leveren væv. Dernæst skar portåren nær den hepatiske hilum. Ca. 4 cm craniale af infrahepatic cava clamp, skære et hul i den forreste væg af vena cava. I dette hul, placere stikket på bypass 'Caval åbning med Luer Lock vender fortil. Fastgør stikket i infrahepatic cava med 1-0 silkeslips. Åbn derefter slangen klemme på det Caval gren af ​​bypass. Endelig åbner infrahepatic cava klemme til at tillade en Caval-jugularis bypass i tillæg til den eksisterende porto-jugularis bypass. Øge pumpehastigheden til omkring 2.500 runder / min, således at bypass udstrømning på jugularis side er mellem 900 – 1.100 ml / min. Udskære leveren ved dens resterende connection kraniel til infrahepatic bypass-stik, der sikrer, at de bånd, der holder bypass-forbindelse er ikke skæres. Placer bypass forsigtigt slangen for at undgå knæk. Giv 500 mg methylprednisolon at initialisere immunosuppression. 3. Fartøjets Genopbygning Ved hjælp af 4-0 monofilament polypropylen suturer, tæt alle 3 phrenic vene Ostia på modtagerens side i suprahepatic cava blænde. Stitch dobbelt-bevæbnet 4-0 monofilament polypropylen suturer inside-uden i begge hjørner af suprahepatic cava på modtagerens side. Fjern donororganet posen fra frostboks. Åbne orgel taske, fjern donor leveren, og placere den i bughulen. For en end-to-end anastomose af suprahepatic cava, trimme donor suprahepatic vena cava til at passe modtageren side. Brug af indvendige nåle af modtagerens side hjørne sømme, gør en indvendig-uden hjørne sting på hver af siderne af suprahepatic donor cava. Et skud begge ender af den rigtige sutur sammen. Tilnærme både ostia af modtager og donor cava, derefter binde begge endelser venstre sutur. Skudt den kortere ende og gøre en uden-indvendig søm modtagerens cava bagvæggen siden af ​​slips. Kør over bagvæggen, ideelt udkrængning af cava vægge. Tilføj 2-3 forreste væg sømme med samme sutur når højre side er nået, så skød denne sutur slutning. Kør over den forreste væg med det resterende sutur fra venstre hjørne. Binde sammen begge suturer anvendes til ryggen og forreste vægge. Bind de to andre sutur endelser i højre hjørne. Efter trimning donor portal vene til en passende længde, udføre en ende-til-ende portal vene anastomose på samme måde under anvendelse af 6-0 monofilament polypropylen suturer. Kort før efterbehandling med forvæggen, intubere lumen infrahepatic cava med en anden flush linje og skyl UW opløsning med 1 I saltvandved stuetemperatur via infrahepatic cavaportal vene. Fuldføre anastomose og binde suturerne, efterlader ca. 0,5 cm af vækstfaktor. Sagt på en anden De Bakey- Beck klemme på donor infrahepatic cava. Åbn suprahepatic cava klemme og tjekke for blødning. Derefter reperfundere leveren ved at åbne portalen klemme. Brug 6-0 monofilament polypropylen suturer for hæmostatiske sting. Reducer bypass pumpens hastighed til omkring 1.500 runder / min og luk klemmen af ​​portalen kappe introducer kateter. Spænd modtageren side af infrahepatic vena cava og sætte en slange klemme på Caval del af bypass. Stop centrifugalpumpe. Skær de bånd af Caval stik og fjern det. Returnere den resterende blod fra bypass til grisen gennem jugularis kateter. Luk klemmen af ​​jugularis kateter og frakoble bypass. Giver 100 mg protaminsulfat at antagoniserer heparin. Vær særlig forsigtig af pig s hæmodynamik under disse trin; bruge catecholamin for pres støtte og erstatning natriumbicarbonat for metabolisk acidose. Udfør en ende-til-ende anastomose af infrahepatic cava igen på måden beskrevet ovenfor ved anvendelse 5-0 monofilament polypropylen suturer. Reperfundere den infrahepatic lavere cava ved at frigive begge klemmer. Trim en aortal plaster rundt donorens cøliaki stammen. Bind off modtageren gastroduodenale arterie tæt på den fælles hepatisk arterie. Sætte en bulldog klemme på den fælles hepatisk arterie proximalt til krydset af gastroduodenale arterie. Trimme en lille arteriel plaster med en Potts saks, ved hjælp af den vaskulære væv omkring krydset. Skyl donor hepatiske arterie med 10 ml hepariniseret saltvand og sætte en anden bulldog klemme længere distalt at undgå tilbage blødning. Anastomose det arterielle ostia ende mod ende i en kørende faldskærm teknik under anvendelse af en 6-0 monofilament sutur polypropylen. Reperfundere ved først åbning den distale og derefter de proximale bulldog klemmer. Anastomose galdegang ende-til-ende med 2 6-0 monofilament polypropylen suturer under anvendelse af løbeteknik beskrevet ovenfor. Sørg for, at store dele af peribiliary væv er inkluderet, fordi svine- galdegang er meget skrøbelig og tårer nemt. Efter kontrol for hæmostase, fjerne hylsteret introducer kateteret fra milten vene. Luk de proksimale og distale ender med de resterende 2 bånd. Luk bugvæggen med en størrelse 1 monofilament absorberbar sutur. Luk huden enten med en hud hæftemaskine eller en kørende 2-0 sutur. 4. Postoperativ fase Brug varmepuden og varme-cirkulerende tæppe til at holde grisen varm. Sample blodgasser hver time. Juster dehydrering ved at øge infusionshastigheden. Vænne anæstesi. Ventilere grisen i yderligere 2 timer. Fjern hylsteret indføringskateteret fra venstre halsvene vei. Tryk fast i et par minutter for at forhindre blødning. Tunnel TPN kateteret subkutant til den side af grisens hals. Fastgør det med 2-0 suturer. Fjern den arterielle linje efter 2 timer, hvis grisen er hæmodynamisk stabil uden catecholamin støtte. Sørg for, at punktere side ikke er blødning. Ellers lave en 6-0 pung-string sting omkring arterielle hul uden at lukke arterien. Luk incisionssted. Standse ventilationen, når grisen er i stand til at ånde selvstændigt. Afbryd ventilation slangen fra luftrørsslangen. Gentagne gange kontrollere, om grisen trækker vejret tilstrækkeligt. Placer gris i en liggende stilling i et enkelt dyr pen forsynet med en varmelampe. Ekstuberes når grisen er i stand til at holde op hovedet selvstændigt. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Huset grisen separat for hele post-operative periode. Givetilstrækkelig iv smertestillende medicin postoperativt (fx buprenorphin 0,01-0,05 mg / kg hver 6 timer). Hvis grisen ikke drikker selvstændigt, erstatte nok volumen iv Fortsæt methylprednisolon som immunsuppression (250 mg postoperative dag (POD) 1 morgen og derefter 125 mg hver morgen). Start cephalosporin 2 mg / kg po to gange daglig fra POD2 på. Administrere 500 mg metronidazol og 1.000 mg cefazoline to gange dagligt, samt 20 mg pantoprazol en gang dagligt indtil POD3. Overvåg grisen nøje. Tøv ikke med at ofre det, hvis det viser tegn på lidelse (fx sløvhed, refusion til at drikke, vedvarende acidose eller hypoglykæmi, eller tegn på blødning eller peritonitis). For eutanasi, exsanguinate grisen under dyb isofluran anæstesi (5%,> 2,5 MAC) ved at skære suprahepatic cava.

Representative Results

I en første transplantation undersøgelse, en hjerte-bankende donor model (HBD, n = 5) blev sammenlignet med en DCD model (n = 10) eksponeret for 45 min af varm iskæmi in situ. I begge grupper blev transplantater bevaret på is i 10 timer efter indkøb. I HBD gruppen, 100% af de modtagende grise overlevede indtil slutningen af ​​opfølgningen på dag 5 efter transplantation. I DCD-gruppen, kun 50% af de modtagende svin overlevede i 5 dage grundet koagulation problemer eller metabolisk dekompensation, som følge af nedsat postoperativ leverfunktion. Alle blodprøver blev opsamlet fra den centrale venekateter. Efter centrifugering blev serumprøver opnået og analyseret for hepatocellulær skade (aspartat-aminotransferase, AST), biliær funktion (total bilirubin og alkalisk phosphatase), og leverfunktionen (INR). Tidsforløbet for hver markør er vist i figur 2 – 5,. <p class="jove_content"> AST niveauer toppede efter 24 timer (1414 ± 538 U / L i HBD-gruppen og 2296 ± 1313 U / L i DCD-gruppen, p = 0,13) og vendte tilbage til næsten normale værdier efter 5 dage. Ligeledes blev alkalisk phosphatase værdierne steg markant efter 36 timer i DCD-gruppen (224 ± 111 U / L) sammenlignet med HBD-gruppen (162 ± 54 U / L, p = 0,27). Mens total bilirubin var stabil i HBD-gruppen (≤ 10 mmol / l hele), er det gradvist øget i DCD-gruppen indtil dag 5 (23 ± 31 mmol / l, p = 0,43). Den store standardafvigelse i bilirubin værdier i DCD koncernen viser en ejendommelig heterogenitet biliær skade i denne gruppe. INR som en markør af leverfunktion viste en tendens svarer til AST værdier. Værdier toppede på 24 timer og blev gendannet til næsten normale værdier efter 5 dage. HBD gruppe havde lavere værdier med en top ved 1,47 ± 0,34 i sammenligning med DCD gruppen (top 1,70 ± 0,36, p = 0,32). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-side = "altid"> Figur 1. Ordningen af porto-Caval-jugularis shunt. Bypass er fyldt med Ringerlaktat løsning. Derefter Caval del fastspændes med en slangeklemme, der jugularis og milt dele forbundet til de forudindstillede katetre, er bypass åbnes, og centrifugalpumpen startes efter portal venøs fastspænding. Efter leverresektion er cava del af bypass indsat og fastgjort i infrahepatic vena cava stump, kraniel til de renale vener. Slangen klemme frigøres for at tillade cava dekompression, udover portalen dekompression. Figur 2. aspartat aminotransferase (AST) (HBD n = 5, DCD n = 10). AST er en følsom markør af hepatocellulær skade. Toppen agtersteER 24 timer er lavere i HBD end i DCD-gruppen, hvilket tyder på mindre hepatisk reperfusionsskade; den mindre standardafvigelse viser mere homogene resultater i HBD gruppen. Figur 3. Samlet bilirubin (HBD n = 5, DCD n = 10). Total bilirubin, som en markør af galdeudskillelse og galdegang integritet, viser en stabil og homogen tendens med værdier under 10 mmol / l i HBD gruppen. Bilirubin kurve i DCD gruppen øges gradvist over tid og viser en høj standardafvigelse, hvilket tyder biliær skade i kun en del af den eksperimentelle gruppe. Figur 4. Alkalisk phosphatase (HBD n = 5, DCD n = 10). Alkalisk phosphatase ir en indikator for biliær skade. Værdierne for HBD gruppen er lavere end den DCD gruppen, hvilket indebærer mindre biliær skade. Figur 5. INR (HBD n = 5, DCD n = 10). En høj værdi indikerer INR formindsket hepatocellulær funktion på grund af nedsat frigivelse af koagulationsfaktorer. I begge HBD og DCD grupper de INR-værdier vender tilbage til normale værdier 5 dage efter transplantation, hvilket tyder på genvinding af leverfunktionen. Værdierne for HBD gruppe vises lavere.

Discussion

Eksperimentel porcint OLTx er en udfordrende procedure for en forskning indstilling uden de intensivafdelinger ressourcer af en klinisk scenario. Mulige komplikationer omfatter hæmodynamisk ustabilitet, blødning, orgel iskæmi, hypotermi, og metabolisk samt respiratoriske, dekompensation. For enhver forskergruppe, tilstrækkelig proceduremæssig træning af kirurgiske teknik ⁵ samt grisen anæstesi ^14,15 er obligatorisk for at opnå repræsentative og reproducerbare resultater.

Mange tekniske finesser er blevet beskrevet i litteraturen, især med hensyn til den vaskulære rekonstruktion fase ^5. Den OLTx ovenfor beskrevne protokol giver de nødvendige oplysninger for en cava-erstatte model ligner human OLTx. De resultater viser pålidelig dyr overlevelse og graft opsving i både HBD og DCD-modeller. Protokollen gælder i korte overlevelse scenarier, der anvendes i graft reperfusion experiments, for eksempel, såvel som i langsigtede overlevelse modeller som tolerance undersøgelser.

En stor hindring for porcint OLTx er den relativt ringe tolerance cava og portal vene cross-fastspænding. Splanknisk trafikbelastning i den anhepatic fase forårsager venøs hypertension og kapillær skader, der kan føre til større intestinal iskæmi og hæmodynamisk ustabilitet til punktet af en irreversibel chok, selv efter organ reperfusion ^7. Da vena cava er helt indlejret i leveren parenkym, en cava-bevare piggy-back procedure ikke er mulig. Den samlede okklusion af vena cava under cava genopbygningsfasen svækker hæmodynamiske stabilitet af grisen. Selv om et par rapporter viser, at svine OLTx kan opnås under total cava og portal vene okklusion af mindre end 25 min ^16,17, en porto-cava-jugularis bypass teknik til den tid af vaskulær rekonstruktion er sikrere og mere praktisk løsning ^{7- 9,18.} I the forfatternes erfaring, en passiv porto-jugularis bypass ikke er optimal til at holde grisen hæmodynamisk stabil i anhepatic fase. Bypass-modellen, herunder aktiv dekompression af både infrahepatic cava og portal vene, giver en rolig genopbygning fase af suprahepatic Caval og portal anastomoser selv med udvidet fastspænding tid på grund af uforudsete komplikationer. I modsætning til tidligere rapporter ^7, en splenektomi er ikke obligatorisk, når portalen bypass kateteret fjernes. Både milt-arterie og vene er lukket omkring halvvejs langs milten længde forlader den proximale halvdel tilstrækkeligt perfunderet. Komplikationer som blødning eller luftemboli på grund af bypass frakobling kan undgås ved at sikre, at bypass er placeret omhyggeligt og sikret korrekt.

I langsigtede overlevelse OLTx eksperimenter, er galdegang anastomose betragtes et svagt punkt på grund af sin høje komplikation sats ^19. Den galde væv er meget skrøbelig og needs særlig forsigtig, når der håndteres. Mange forskellige anastomose teknikker er blevet beskrevet ^5,19. En ende-til-ende anastomose er teknisk let og forbundet med minimale komplikationer ^19. En kontinuerlig sutur med en ikke-skærende nål herunder store sektioner af peribiliary bindevæv forekommer at være bedre end en afbrudt sutur. Galdegangen er placeret under unødvendig spænding, når de enkelte sting i den afbrudte sutur er knudret. Dette kan resultere i væv tårer og fortløbende galde lækager. Suturmaterialet – absorberbare eller ikke-absorberbare – er normalt ikke vigtigt i betragtning af dens begrænsede levetid indtil grisen afsluttes. For langsigtede overlevelse modeller over flere måneder, absorberbare suturer – ligesom i human OLTx – er at foretrække.

Særlig pleje skal tages med postoperativ opfølgning. Tilstrækkelig ernæring og væsketilførsel, en pålidelig smertelindring protokol og en ordentlig immunosuppressionregime er obligatoriske. For langsigtede eksperimenter, synes særlig vigtig immunosuppression. Sammenlignet med andre pattedyr, svin viser en overraskende lav immunologisk afstødning sats efter OLTx ^20,21. Runde celle infiltrationer er maksimal under den anden uge efter transplantation og mindske spontant selv uden immunosuppression. Afvisning er sjældent dødsårsagen efter svine OLTx ^22. Men selv med den immunosuppression protokol involverer indgivelse steroider iv og calcineurinhæmmere po nævnt her, er transplantatafstødning angivet med en mild stigning i transaminaser starter ved omkring 4 dage efter OLTx og bekræftet ved tilsyneladende portal felt rundt celleinfiltration. Kan gives enten po ^23,24 eller iv ^25,26 calcineurinhæmmere; begge fremgangsmåder har ulemper. Selv med orale ansøgning hjælpemidler, det faktiske beløb nå mave-tarmkanalen er fortsat undvigende. På den anden side, kontinuerlig iv infusion ien gris pen med en aktiv dyr er vanskelig. Derfor skal iv ansøgningen udføres som en bolus, hvilket resulterer i høj lægemiddelkoncentrationsenhederne toppe sammen med potentielle toksiske virkninger. Ikke desto mindre de to metoder til anvendelse synes at tillade langsigtede overlevelse.

Svarende til et klinisk miljø, er postoperativ stress ulcus profylakse anbefales. Postoperativ blødning fra mavesår er et hyppigt problem og kan være relateret til en nedsat leverfunktion ^27. Efter et par tilfælde af gastrointestinal blødning i begge OLTx grupper forfatterne begyndte regelmæssige profylakse med pantoprazol og oplever ikke nogen gastrointestinal blødning lige siden.

Streng vedligeholdelse af sterile forhold intraoperativt, der kan sammenlignes med forholdene i et klinisk operationsstuen, og deraf følgende antibiotisk profylakse, mindsker risikoen for infektiøse komplikationer.

Afslutningsvis denne artikel provides praktisk information om et svin OLTx program i en forskning indstilling. Tilstrækkelig engagement, praksis, og teamwork er vigtigt for at mindske læring periode, til at producere pålidelige resultater, og for at reducere omkostningerne og antallet af forsøgsdyr.

Materials

Atropine Sulphate 15mg/30mL	Rafter 8 Products	238481
Buprenorphine 0.3mg/mL	RB Pharmaceuticals LDT	N/A
Cefazolin 1g	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2237138
Cyclosporin Oral Solution 5000mg/50mL	Novartis Pharmaceuticals Canada Inc.	2150697
Fentanyl Citrate 0.25mg/5mL	Sandoz Canada Inc.	2240434
Heparin 10,000iU/10mL	Leo Pharma A/S	453811
Isoflurane 99.9%, 250mL	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2231929
Ketamine Hydrochloride  5000mg/50mL	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	612316
Lactated Ringer’s + 5% Dextrose, 0.5L	Baxter Corporation	61131
Lacteted Ringer’s, 1L	Baxter Corporation	61085
Metronidazole 500mg/100mL	Baxter Corporation	870420
Midazolame 50mg/10mL	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2242905
Pantoprazole 40mg	Sandoz Canada Inc.	2306727
Potassium Chloride 40mEq/20mL	Hospira Healthcare Corporation	37869
Propofol 1000mg/100mL	Pharmascience Inc.	2244379
Protamine Sulfate 50mg/5mL	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2139537
Saline 0.9%, 1L	Baxter Corporation	60208
Sodium Bicarbonate 50 mEq/50mL	Hospira Healthcare Corporation	261998
Solu-Medrol 500mg	Pfizer Canada Inc.	2367963
Tranexamic Acid 1000mg/10mL	Pfizer Canada Inc.	2064413
University of Wisconsin Solution, SPS-1	Organ Recovery Systms	SPS-1
Xylocaine Endotracheal 10mg/50mL	AstraZeneca	2003767
Appose ULC 35W skin stapler	Covidien Canada	803712
Maxon, 1	Covidien Canada	606173
Sofsilk, 0	Covidien Canada	S606
Sofsilk, 2-0	Covidien Canada	S405
Sofsilk, 3-0	Covidien Canada	S404
Surgipro II, 4-0	Covidien Canada	VP581X
Surgipro II, 5-0	Covidien Canada	VP725X
Surgipro II, 6-0	Covidien Canada	VP733X
Catheter i.v, 18 G	BD Canada	381147
Cook TPN catheter, 9.5Fr	Cook Medical Company	C-TPNS-9.5-90
PSI Kit for sheath catheter, 8.5Fr	Arrow International	ASK-09803-UHN
Infusion Pump Line	Smith Medical ASD Inc.	21-0442-25
Liver Admin Set (flush line)	CardioMed Supplies Inc	17175
Mallinckrodt, Tracheal Tube, 6.5mm	Covidien Canada	86449
Med-Rx Suction Connecting Tube	Benlan Inc.	70-8120
Organ Bag	CardioMed Supplies Inc	2990
Suction Tip	Tyco Healthcare Group LP	8888501023
Valleylab, Cautery Pencil	Covidien Canada	E2515H
Valleylab, Patient Return Electrode	Covidien Canada	E7507
Bypass Connector 3/8” x 1/4“	Raumedic AG	955083-001
Bypass Connector 3/8” x 3/8” Luer Lock	Raumedic AG	955163-001
Bypass Connector Y 3/8” x 3/8” x 1/4”	Raumedic AG	961360-002
Bypass Tubing 1/4” x 1/16”	Raumedic AG	039505-010
Bypass Tubing 3/8” x 3/32”	Raumedic AG	039535-005
Rotaflow Cenrtifugal Pump	Maquet-Dynamed	HC 2821
Stainless Steel Hose Clamp Ring, 5mm	Oetiker	16700007
Abdominal Retractor	Medite GmbH	N/A
De Bakey – Beck, Infrahepatic Cava Clamp	Aesculap Inc.	FB519R
Diethrich, Atraumaitc Clamp (Portal Vein)	Aesculap Inc.	FB525R
Gregory Bull Dog Clamp, curved	Aesculap Inc.	FB382R
Gregory Bull Dog Clamp, straight	Aesculap Inc.	FB381R
Potts – De Martel, Scissors	Aesculap Inc.	BC648R
Satinsky, Suprahepatic Cava Clamp	Aesculap Inc.	FB605R
Symetrical Tubing Clamp	Codman Instruments	198010
Anesthesia Machine, Optimax	Moduflex Anesthesia Equipment	SN5180
Bypass Flow meter, HT 110	Transonic Systems Inc.	HT110B11106
Flow meter probe, H6XL	Transonic Systems Inc.	H6Xl689
Heat Therapy Pump, T/Pump	Gaymar Industries Inc	TP500-G89D19
Infusion Pump 3000	SIMS Graseby LTD.	SN300050447
Isoflurane Vapor 19.1	Draeger Medical Canada Inc.	N/A
Monitor, Datex AS 3	Instrumentarium Corp./ Hitachi	D-VHC14-23-02
Rotaflow Centrifugal Drive Unit	Marquet-Dynamed	952301
Rotaflow Console	Marquet-Dynamed	706035
Temperature Therapy Pad	Gaymar Industries Inc	TP26E
Valleylab Force Tx	Valleylab Inc.	216151480
Ventilator, AV 800	DRE Medical Equipment	40800AVV
Warm Touch, Patient Warming System	Nellcor/ Covidien Canada	5015300A