Tecnica di Suini appalti Fegato e trapianto ortotopico con un attivo Porto-Caval Shunt

Summary

Experimental animal research plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. The porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) closely resembles human conditions and is frequently used in clinically oriented research. The following protocol contains all information for a reliable porcine OLTx model using an active porto-caval-jugular shunt.

Abstract

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation waiting list die without receiving an organ transplant or are delisted due to disease progression. Even after a successful transplantation, rejection and side effects of immunosuppression remain major concerns for graft survival and patient morbidity.

Experimental animal research has been essential to the success of liver transplantation and still plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. In particular, the porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) is optimal for clinically oriented research for its close resemblance to human size, anatomy, and physiology.

Decompression of intestinal congestion during the anhepatic phase of porcine OLTx is important to guarantee reliable animal survival. The use of an active porto-caval-jugular shunt achieves excellent intestinal decompression. The system can be used for short-term as well as long-term survival experiments. The following protocol contains all technical information for a stable and reproducible liver transplantation model in pigs including post-operative animal care.

Introduction

Trapianto di fegato (OLTx) è l'unica opzione di trattamento per i pazienti con malattia epatica allo stadio terminale o carcinoma epatocellulare avanzato. Negli ultimi 25 anni, il numero dei candidati in lista d'attesa è progressivamente aumentato e ora supera di gran lunga il numero di innesti disponibili. Nella maggior parte delle regioni di trapianto, dal 20 al 30% dei pazienti in lista di attesa per trapianto di fegato muoiono senza ricevere un trapianto d'organo o di esclusione dalle negoziazioni a causa della progressione della malattia. Strategie per aumentare il pool di donatori e, quindi, il numero di innesti a disposizione, sono disperatamente necessari. Criteri di assegnazione degli organi estese, conservazione trapianto prolungato, e induzione della tolleranza immunologica rappresentano ancora grandi sfide cliniche ^1-3. Quindi, la ricerca sperimentale OLTx è fondamentale al fine di ottimizzare clinica pratica OLTx.

Suini OLTx è un modello sperimentale consolidata che assomiglia OLTx umano in molti modi, tra cui ldimensioni Iver, l'anatomia, la fisiologia e ^4-6. Così, è diventato un metodo sperimentale standard campi di ricerca quali tecniche chirurgiche, la fisiologia, l'immunologia, la conservazione, e danno da ischemia-riperfusione. Numerose tecniche di approvvigionamento graft, destinatario epatectomia, e, soprattutto, la ricostruzione vascolare, sono stati descritti in letteratura ^5. La scelta della tecnica appropriata varia in base alle preferenze del ricercatore e capacità tecnica.

Contrariamente allo scenario umano, congestione splancnico durante la fase anepatica rappresenta un problema importante in porcine OLTx. La successiva ischemia intestinale e danno vascolare congestizia possono causare grave instabilità emodinamica, mettendo a repentaglio la sopravvivenza di maiale e, quindi, il successo dell'esperimento ^7-9. Pertanto, sufficiente la decompressione intestinale è obbligatorio, soprattutto in contesti sperimentali tecnicamente meno raffinati.

Noiing un porto-cavale-giugulare shunt attivo per tutta la durata della fase di anepatica è un'opzione affidabile per evitare la congestione intestinale. Il sistema può essere utilizzato per esperimenti riperfusione precoce nonché scenari di sopravvivenza a lungo termine. Il protocollo che segue contiene tutte le informazioni per un fegato modello di trapianto di stabili e riproducibili nei suini, compresi gli appalti di fegato da donatore, operazione destinatario, incluso epatectomia e tecniche di ricostruzione nave end-to-end, e cure post-operatorie.

Protocol

Tutti gli animali hanno ricevuto la cura umana nel rispetto dei '' Principi di cura degli animali da laboratorio '' formulate dalla Società Nazionale per la ricerca medica e la '' Guida per la cura di animali da laboratorio '' pubblicato dal National Institutes of Health, Ontario, Canada . Il Comitato del Research Institute di Toronto Generale cura degli animali ha approvato tutti gli studi. 1. Organo Retrieval Casa maschi Yorkshire suini tra i 30 ei 35 kg nella struttura di ricerca per 1 settimana prima del trapianto per evitare una reazione fisica indotta da stress (che possono alterare l'esito del perfusione 10,11) e acclimatare gli animali alle condizioni abitative. Velocemente il maiale per un minimo di 6 ore prima dell'induzione dell'anestesia. Anestetizzare il maiale donatore tramite iniezione intramuscolare (im) di una miscela di ketamina (25 mg / kg), atropina (0,04 mg / kg), e midazolam (0,15 mg / kg). </li> Prima di intubazione, assicurare il maiale respira spontaneamente 2 litri di ossigeno dosato con il 5% di isoflurano. In posizione supina, spruzzare le corde vocali con lidocaina al 2% 2 minuti prima l'intubazione per evitare spasmi delle corde vocali. Per un maiale di 35 kg, utilizzare un tubo tracheale 6.5 p. Bloccare il tubo tracheale con 3-5 ml di aria ambiente. Dopo l'intubazione, utilizzare capnometria per confermare il corretto intubazione. Monitorare la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno per pulsossimetria in coda del maiale. Abbassare il vaporizzatore isoflurano al 2%. Regolare la profondità dell'anestesia da valori di concentrazione alveolare minima (MAC); mirare a 2 – 2,5 MAC. Impostare il ventilatore 14 – 16 respiri / min e un volume corrente di 10 – 15 ml / kg di peso corporeo. Inserire un 18 G endovenosa (iv) del catetere in una vena dell'orecchio per consentire l'infusione di soluzione di lattato di Ringer (200 ml / h). Scrub il maiale e coprire con teli sterili. Dopo aver verificato le condizioni di sterilità, fare un follo mediana laparotomiacon a capo una estensione laterale sinistro. Usare un panno per coprire grandi e piccoli intestino prima di spostarli sul lato sinistro. Dividere il legamento falciforme e il legamento triangolare con una cauterizzazione. Rilasciare il fegato dal diaframma sul lato destro utilizzando un elettrobisturi; utilizzare le forbici per la parte superiore tra la cava e il diaframma. Sezionare cava infraepatica giù al ramo della vena surrenalica sul lato destro e la vena renale sul lato sinistro. Separare cava infraepatica e dell'aorta distale uno dall'altro; legare rami aortici alla colonna vertebrale; isolare e arterie renali liberi dal tessuto aderente. Surround ogni arteria renale con una cravatta 2-0. Cranica alla vena renale sinistra, sezionare l'aorta e l'arteria mesenterica. Circondano l'arteria mesenterica con una cravatta 2-0. Dopo l'apertura del cranio peritoneo per mesenterica, seguire attentamente l'aorta verso il tronco celiaco. Sezionare il tronco celiaco caudalmente al portale vein; circondano le arterie gastriche milza e di sinistra, che si diramano posteriormente fuori dal tronco celiaco. Sezionare il tronco celiaco largo della vena porta. Rilasciare la vena porta da una incisione peritoneale tra il pancreas e vena porta. Legare le vene che drenano dal pancreas alla vena porta. Separare il dotto biliare dal legamento epatoduodenale e dividerlo distale dopo la legatura. Legare i vasi linfatici all'interno del legamento epatoduodenale per evitare perdite linfatico. Dividete l'arteria gastroduodenale e arterie gastriche destra tra legami. Legare le vene più piccole. Sezionare l'aorta dietro il diaframma tra il tronco cuore e per celiaci. Posizionare un pareggio per 2-0 in tutto il cranica all'aorta al tronco celiaco. Rimuovere la cistifellea e cauterizzare qualsiasi sanguinamento dal letto cistifellea. Aprire il diaframma. Somministrare 1.000 UI / kg di peso donatore di eparina intracardiaca o iv Impostare isoflurano al 5% (> 2.5 MAC) per ottenereun livello più profondo anestetico. Per un donatore dopo la morte circolatorio (DCD) modello, indurre arresto cardiaco mediante iniezione intracardial di 40 mval KCl 3 minuti dopo la somministrazione di eparina. Imposta arresto cardiaco come punto di partenza di ischemia calda. Legare largo delle precedentemente impostati fasce intorno renale, della milza, mesenterica, e le arterie gastrica sinistra. Legare l'aorta distale tra le arterie renali e iliache e incannulare l'aorta con una linea a filo organo. Legare la vena porta come prossimale possibile e cannulare con un'altra linea filo organo. Dopo aver chiuso il pre-set cravatta intorno all'aorta prossimale, lavare il fegato con 2 litri di freddo University of Wisconsin soluzione (UW) con doppio perfusione via dell'aorta (sacchetto pressione) e della vena porta (gravità-driven). Accise il fegato, lasciando tutti gli altri pescherecci lungo. Lascia un generoso bordo diaframmatica intorno alla cava sovraepatica. Posizionare il fegato in un sacchetto organo sterile su ghiaccio. Durante back-tavolo di preparazione, clamp cava sovraepatica utilizzando un morsetto Satinsky e sciacquare il fegato una seconda volta con circa 0,5 L di soluzione UW retrogradely tramite la vena cava inferiore inferiore finché il deflusso della vena porta è chiara. Legare tutti i rami arteriosi del tronco dell'aorta e per celiaci. Eseguire una perfusione pressione arteriosa back-tavolo con il restante 0,5 L di soluzione UW 12. Lavare il dotto biliare con soluzione UW. Tagliare la patch diaframmatica di dimensioni adeguate. Chiudere tutte le vene frenico – di solito 3, 1 ciascuno a destra ea sinistra, e 1 posteriore – con 4-0 punti di sutura monofilamento di polipropilene. Chiudere il sacchetto organo e memorizzare il fegato in ghiaccio. 2. Destinatario epatectomia Anestetizzare il maiale destinatario un'iniezione im di una miscela di ketamina (25 mg / kg), atropina (0,04 mg / kg), e midazolam (0,15 mg / kg). Posizionare il maiale in posizione supina su un tavolo operatorio sulla cima di una stuoia di riscaldamento. Coprire il wi maialeth una coperta a ricircolo del calore. Prima di intubazione, assicurare il maiale respira spontaneamente 2 litri di ossigeno dosato con il 5% di isoflurano. Spruzzare le corde vocali con lidocaina al 2% 2 minuti prima l'intubazione per evitare spasmi delle corde vocali. Per un maiale di 35 kg, utilizzare un tubo tracheale 6.5 p. Bloccare il tubo tracheale con 3-5 ml di aria ambiente. Dopo l'intubazione, utilizzare capnometria per confermare il corretto intubazione. Monitorare la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno per pulsossimetria in coda del maiale. Posizionare e fissare una sonda di temperatura nel muso del maiale. Abbassare il vaporizzatore isoflurano al 2% (obiettivo per 2-2,5 MAC). Impostare il ventilatore 14 – 16 respiri / min e un volume corrente di 10 – 15 ml / kg di peso corporeo. Usare pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Utilizzare Seldinger tecnica 13 per inserire un induttore guaina (8,5 Fr) nella sinistra vena giugulare esterna. Utilizzare questo catetere in seguito per un attivo portale-caval-giugulare bypass. Utilizzare Seldinger technique inserire una nutrizione parenterale (TPN) catetere totale (9,5 Fr) nella vena giugulare destra esterna. In condizioni sterili, sezionare la carotide destra e inserire un catetere di polipropilene (18 G) per il monitoraggio della pressione arteriosa invasiva. Circondano l'arteria con una cravatta di seta 2-0 per permettere la legatura d'emergenza. Abbassare il vaporizzatore isoflurano al 1% (1,5-2 MAC) e aggiungere propofol (5-8 mg / kg / ora iv) per mantenere la profondità dell'anestesia. Per l'analgesia, utilizzare iv infusione continua di fentanil citrato (più preferito, 2 mg / kg / ora) o remifentanil (seconda scelta, 15 mg / kg / ora). Prima incisione cutanea, dare 1.000 mg di cefuroxima e 500 mg di metronidazolo ev. Impostare una pompa per infusione con Ringer lattato con 5% di glucosio a 150 ml / h. Posizionare la coperta a ricircolo di calore sulla zona della testa e del collo. Scrub il maiale e coprire con teli sterili. In condizioni sterili, fare una laparotomia mediana. Inserire una r addominaleetractor per ottenere un sufficiente accesso al quadrante superiore destro. Dividere il legamento falciforme e il legamento triangolare con cauterizzazione. In più passaggi, dividere il legamento epatoduodenale vicino al fegato tra i legami. Identificare, dividere, e segnare i rami del dotto biliare e dell'arteria epatica. Sezionare l'arteria epatica retrograda fino alla divisione dell'arteria gastroduodenale. Assicurarsi che un morsetto bulldog combacia con la comune dell'arteria prossimale epatica all'arteria gastroduodenale per dopo il serraggio. Liberare la vena porta dal tessuto aderente. Mobilitare la vena cava dal retroperitoneo sul lato destro con un elettrobisturi. Utilizzare forbici per la parte superiore tra la cava e il diaframma. Sezionare cava infraepatica giù al ramo della vena surrenalica sul lato destro e la vena renale sul lato sinistro. Esporre l'ilo della milza. A metà percorso la lunghezza della milza, con attenzione chiaraf splenica e la vena da strati peritoneali aderito. Surround sia splenica e la vena di 4 2-0 cravatte di seta. Inserire un 8.5 Fr guaina induttore con 2 fori supplementari nella punta del catetere nella vena splenica, che punta distale verso la vena porta. Fissare il catetere distale al suo inserimento con uno dei 2-0 legami e chiudere la vena prossimale all'inserimento con un altro 2-0 cravatta. Lasciare le altre 2 legami aperto. Prelevare il sangue dal catetere, lavare con 10 ml di soluzione salina, e chiudere il morsetto del catetere. Riempire soluzione salina in un bypass consiste di una testa centrifuga pompa, un tubo giugulare (3/16 "), e l'afflusso sia un ramo portale (3/16") e un ramo cavale (1/4 ", il connettore Luer Lock prossimale apertura). Mettere un morsetto del tubo sull'estremità prossimale del tubo cava. Collegare il portale e l'apertura giugulare della tangenziale di entrambi i cateteri introduttore (Figura 1) e sigillare la connection con un anello di fascetta metallica. Mettere la testa della pompa centrifuga nella posizione della pompa. Dare 1.000 mg di acido tranexamico e 10.000 UI di eparina 3 min iv prima di clampaggio. Ridurre la velocità di infusione di propofol a 2 mg / kg / ora per il tempo della fase anepatica. Regolare la concentrazione isoflurano per la pressione arteriosa e la reattività del maiale. Aprire i ganci di entrambi i cateteri introduttori guaina e cross-clamp la vena porta. Assicurarsi che il sangue è in esecuzione attraverso il bypass passivamente. Avviare la pompa centrifuga a circa 1.500 giri / min. Continuare bloccaggio trasversale se a) il maiale è cardiovascularly stabile e b) il bypass è in esecuzione a circa 500 ml / min. Se il maiale non tollera il clampaggio, il volume sostituto (cristalloidi o colloidi) e agenti inotropi (noradrenalina in piccolo boli). Croce morsetto della vena cava infraepatica solo cranica alle vene renali utilizzando un morsetto De Bakey-Beck. Applicare una pressione decisa sulle tiss fegatoue per spremere una parte del sangue residuo. Cross-clamp vena cava sovraepatica tra cui un cerchio diaframmatica utilizzando un morsetto Satinsky mentre ritraendo il fegato caudale. Tagliare la vena cava sovraepatica direttamente al suo confine con il tessuto epatico. Quindi, tagliare la vena porta vicino al ilo epatico. Circa 4 cm craniale del morsetto infraepatica cava, praticare un foro nella parete anteriore della vena cava. In questo foro, posizionare il connettore di apertura by-pass 'cavale con il blocco Luer rivolto anteriormente. Fissare il connettore nella cava infraepatica con 1-0 cravatte di seta. Quindi, aprire il morsetto tubo del ramo cavale della tangenziale. Infine, aprire il morsetto cava infraepatica per consentire un bypass caval-giugulare oltre alla esistente bypass porto-giugulare. Aumentare la velocità della pompa a circa 2500 giri / min tale che il deflusso bypass sul lato giugulare è tra 900 – 1.100 ml / min. Accise il fegato nella sua restante connection cranica al connettore bypass infraepatica, assicurando che i legami che fissano il collegamento di bypass non sono tagliati. Posizionare la tangenziale tubatura con attenzione per evitare attorcigliamenti. Dare 500 mg di metilprednisolone per inizializzare immunosoppressione. 3. Vessel Ricostruzione Utilizzando 4-0 suture in polipropilene monofilamento, vicino tutti e 3 ostia vena frenico sul lato beneficiario al diaframma della cava sovraepatica. Stitch suture a doppio braccio 4-0 monofilamento polipropilene dentro-fuori in entrambi gli spigoli della cava sovraepatica sul lato ricevente. Rimuovere la borsa donatore di organi dal contenitore di ghiaccio. Aprire la busta organo, rimuovere il fegato del donatore, e inserirlo nella cavità addominale. Per un anastomosi end-to-end della cava sovraepatica, tagliare il donatore vena sovraepatica cava per adattarsi al lato ricevente. Utilizzando gli aghi interni dei punti angolari lato ricevente, fare un angolo punto interno-esterno su ciascuno dei lati del suprahcava donatore epatico. Girato entrambe le estremità della sutura destra insieme. Approssimativo entrambi ostia di ricevente e donatore cava, poi legare entrambi i finali della sutura sinistra. Girato alla fine più corto e fare un punto esterno-interno della cava destinatario parete posteriore vicino al pareggio. Eseguire oltre il muro posteriore, idealmente eversione le pareti cava. Aggiungere 2-3 punti della parete anteriore con la stessa sutura volta che il lato destro è stato raggiunto, allora girato questa sutura finale. Eseguire il muro frontale con la sutura rimanente dalla sinistra. Legare insieme entrambe le suture utilizzate per la schiena e le pareti frontali. Legare le altre due finali di sutura in alto a destra. Dopo il taglio della vena porta donatore ad una lunghezza appropriata, eseguire una anastomosi vena end-to-end nello stesso modo, usando suture in polipropilene monofilamento 6-0. Poco prima di terminare con la parete frontale, intubare il lume della cava infraepatica con un'altra linea filo e scovare la soluzione UW con 1 L di soluzione salinaa temperatura ambiente attraverso la vena cavaportal infraepatica. Completare l'anastomosi e legare le suture, lasciando circa 0,5 cm di fattore di crescita. In altre De Bakey- Beck morsetto sulla cava infraepatica donatore. Aprire il morsetto cava sovraepatica e controllare il sanguinamento. Poi, reperfuse fegato aprendo il morsetto portale. Utilizzare suture in polipropilene monofilamento 6-0 per i punti emostatici. Diminuire la velocità della pompa di bypass a circa 1.500 giri / min e chiudere il morsetto del catetere introduttore guaina portale. Fissare nuovamente il lato destinatario della vena cava infraepatica e mettere un morsetto del tubo da parte cavale della tangenziale. Fermare la pompa centrifuga. Tagliare i lacci del connettore cavale e rimuoverlo. Restituisce il sangue residuo dalla tangenziale al maiale attraverso il catetere giugulare. Chiudere il morsetto del catetere giugulare e scollegare il bypass. Dare 100 mg di solfato di protamina per antagonizzare l'eparina. Faccia attenzione di piemodinamica di g durante la procedura; utilizzare catecolamine per pressione di supporto e bicarbonato di sodio sostituto di acidosi metabolica. Eseguire una anastomosi end-to-end della cava infraepatica nuovo nel modo sopra descritto, utilizzando 5-0 suture monofilamento di polipropilene. Reperfuse cava inferiore infraepatica rilasciando entrambi i morsetti. Tagliare una patch aortica intorno tronco celiaco del donatore. Legare il destinatario arteria gastroduodenale vicino alla arteria epatica comune. Mettere un morsetto bulldog sul dell'arteria epatica comune prossimale fino al bivio dell'arteria gastroduodenale. Tagliare una piccola patch arteriosa con una forbice Potts, utilizzando il tessuto vascolare attorno alla giunzione. Lavare l'arteria epatica del donatore con 10 ml di soluzione fisiologica eparinizzata e mettere un altro bulldog morsetto ulteriormente distale per evitare indietro sanguinamento. Anastomose il end-to-end ostia arteriosa in una tecnica paracadute correnti, usando una sutura in polipropilene monofilamento 6-0. Reperfuse dapprima opening distale e quindi i morsetti bulldog prossimali. Anastomose la end-to-end del dotto biliare con 2 6-0 suture monofilamento di polipropilene con la tecnica di corsa sopra descritta. Assicurarsi che le grandi porzioni di tessuto peribiliare sono inclusi perché il dotto biliare suina è molto fragile e strappa facilmente. Dopo aver controllato per l'emostasi, rimuovere il catetere introduttore dalla vena splenica. Chiudere le estremità prossimali e distali con i restanti 2 legami. Chiudere la parete addominale con una dimensione 1 monofilamento sutura riassorbibile. Chiudere la pelle o con una spillatrice pelle o qualsiasi esecuzione 2-0 sutura. Fase 4. Post-operatorio Usare la tastiera di riscaldamento e la coperta a circolazione di calore per mantenere il caldo maiale. Emogasanalisi campione orarie. Regolare la disidratazione, aumentando la velocità di infusione. Svezzare il anestesia. Ventilare il maiale per altre 2 ore. Rimuovere il catetere introduttore dalla giugulare sinistra vein. Premere con forza per qualche minuto per prevenire le emorragie. Tunnel catetere sottocutanea TPN al lato del collo del maiale. Fissate con 2-0 punti di sutura. Rimuovere la linea arteriosa dopo 2 ore se il maiale è emodinamicamente stabile senza il supporto di catecolamine. Assicurarsi che il lato di puntura, non è il sanguinamento. In caso contrario, fare un a borsa di punto 6-0 intorno al foro arterioso senza chiudere l'arteria. Chiudere il sito di incisione. Fermare la ventilazione una volta che il maiale è in grado di respirare autonomamente. Staccare il tubo di ventilazione dal tubo tracheale. Ripetutamente controllare se il maiale è la respirazione a sufficienza. Posizionare il maiale in posizione prona in una sola penna animale dotato di una lampada di riscaldamento. Estubare una volta che il maiale è in grado di tenere su la testa in modo indipendente. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Casa maiale separatamente per l'intero periodo post-operatorio. Forniredolore iv sufficienti di farmaci dopo l'intervento (ad esempio, buprenorfina 0,01-0,05 mg / kg ogni 6 ore). Se il maiale non beve in modo indipendente, sostituire abbastanza volume iv Continuare metilprednisolone come immunosoppressione (giorno 250 mg post-operatorio (POD) 1 del mattino e poi di 125 mg ogni mattina). Avviare cefalosporine 2 mg / kg PO due volte al giorno da POD2 su. Somministrare 500 mg di metronidazolo e 1.000 mg di cefazolina due volte al giorno, e 20 mg di pantoprazolo volta al giorno fino POD3. Monitorare il maiale da vicino. Non esitate a sacrificarlo se mostra segni di sofferenza (per esempio, letargia, rifusione da bere, acidosi persistente o ipoglicemia, o segni di emorragia o di peritonite). Per l'eutanasia, Exsanguinate il maiale sotto anestesia profonda isoflurano (5%,> 2,5 MAC) tagliando la cava sovraepatica.

Representative Results

In un primo studio di trapianto, un modello donatore a cuore battente (HBD, n = 5) è stato confrontato con un modello DCD (n = 10) esposta a 45 min di ischemia calda in situ. In entrambi i gruppi, gli innesti sono stati conservati in ghiaccio per 10 ore dopo l'approvvigionamento. Nel gruppo HBD, il 100% dei suini beneficiari sopravvisse fino alla fine del follow-up il giorno 5 dopo il trapianto. Nel gruppo DCD, solo il 50% dei suini beneficiari sopravvissuto per 5 giorni a causa di problemi di coagulazione o scompenso metabolico, come risultato della funzione epatica post-operatorio diminuito. Tutti i campioni di sangue sono stati prelevati dal catetere venoso centrale. Dopo la centrifugazione, campioni di siero sono stati ottenuti e analizzati per danno epatocellulare (aspartato aminotransferasi, AST), la funzione delle vie biliari (bilirubina totale e fosfatasi alcalina), e la funzione del fegato (INR). Il tempo impiegato per ogni marcatore è illustrata nelle figure 2 – 5. <p class="jove_content"> AST livelli hanno raggiunto un picco dopo 24 ore (1414 ± 538 U / L nel gruppo HBD e 2.296 ± 1.313 U / L nel gruppo DCD, p = 0,13) e sono tornati a valori quasi normali dopo 5 giorni. Analogamente i valori della fosfatasi alcalina sono stati notevolmente aumentati dopo 36 ore nel gruppo DCD (224 ± 111 U / L) rispetto al gruppo HBD (162 ± 54 U / L, p = 0,27). Mentre bilirubina totale è rimasta stabile nel gruppo HBD (≤ 10 micromol / L per tutto), è progressivamente aumentato nel gruppo DCD fino al giorno 5 (23 ± 31 micromol / L, p = 0,43). La grande deviazione standard dei valori di bilirubina nel gruppo DCD mostra una peculiare eterogeneità infortunio biliare in questo gruppo. INR come marker della funzione epatica ha mostrato un andamento simile ai valori AST. Valori ha raggiunto un picco a 24 ore e sono stati ripristinati i valori quasi normali dopo 5 giorni. Il gruppo HBD aveva valori inferiori con un picco a 1,47 ± 0,34 rispetto al gruppo DCD (picco 1,70 ± 0,36, p = 0,32). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Figura 1. Schema dello shunt porto-cavale-giugulare. Il bypass è riempita con una soluzione di Ringer lattato. Poi la parte cava viene serrato con un morsetto del tubo, le parti giugulari e splenici sono collegati ai cateteri pre-impostati, il bypass è aperto, e la pompa centrifuga viene avviato dopo portale serraggio venosa. Dopo resezione epatica, la parte cavale della tangenziale viene inserito e fissato nella infraepatica moncone vena cava, craniale alle vene renali. Il morsetto del tubo viene rilasciato per consentire la decompressione cava, oltre alla decompressione portale. Figura 2. aspartato aminotransferasi (AST) (HBD n = 5, DCD n = 10). AST è un marcatore sensibile di danno epatocellulare. La poppa di piccoer 24 ore è più bassa nella HBD rispetto al gruppo DCD, suggerendo il danno da riperfusione meno epatica; la deviazione standard più piccola mostra risultati più omogenei nel gruppo HBD. Figura 3. bilirubina totale (HBD n = 5, DCD n = 10). Bilirubina totale, come un marcatore della clearance biliare e l'integrità del dotto biliare, mostra un andamento stabile ed omogenea con valori inferiori a 10 mmol / L nel gruppo HBD. La curva bilirubina nel gruppo DCD aumenta gradualmente nel tempo e mostra una deviazione standard alto, suggerendo lesioni biliare in solo una parte del gruppo sperimentale. Figura 4. Fosfatasi alcalina (HBD n = 5, DCD n = 10). Fosfatasi alcalina is un indicatore di danno biliare. I valori per il gruppo HBD sono inferiori rispetto a quella del gruppo DCD, che implica meno lesioni biliare. Figura 5. INR (HBD n = 5, DCD n = 10). Un alto valore di INR indica diminuita funzione epatocellulare a causa della diminuzione rilascio dei fattori della coagulazione. In entrambi i gruppi HBD e DCD, i valori INR tornare a valori normali 5 giorni dopo il trapianto, suggerendo il recupero della funzionalità epatica. I valori per il gruppo HBD appaiono inferiori.

Discussion

Sperimentale suina OLTx è una procedura difficile per un ambiente di ricerca senza le risorse di terapia intensiva di uno scenario clinico. Le possibili complicanze comprendono instabilità emodinamica, emorragia, organo ischemia, ipotermia, e metaboliche, così come le vie respiratorie, scompenso. Per ogni gruppo di ricerca, la formazione procedurale sufficiente della tecnica chirurgica ⁵ nonché al ^14,15 anestesia maiale è obbligatoria per ottenere risultati rappresentativi e riproducibili.

Molti sottigliezze tecniche sono state descritte in letteratura, in particolare per quanto riguarda la fase di ricostruzione vascolare ^5. Il protocollo OLTx sopra descritto fornisce le informazioni necessarie per un modello-cava sostituzione assomiglia OLTx umano. I risultati forniti dimostrano la sopravvivenza animale affidabile e di recupero del trapianto in entrambi i modelli HBD e DCD. Il protocollo è applicabile in situazioni di sopravvivenza a breve termine utilizzati nel trapianto riperfusione esperiments, per esempio, così come nei modelli di sopravvivenza a lungo termine, come studi di tolleranza.

Un grande ostacolo della suina OLTx è relativamente scarsa tolleranza di cava e vena porta clampaggio. Congestione splancnica durante la fase anepatica provoca ipertensione venosa e capillare danni che possono portare a importanti ischemia intestinale e instabilità emodinamica al punto di uno shock irreversibile anche dopo organo riperfusione ^7. Poiché la vena cava è completamente annegato nel parenchima epatico, una procedura piggy-back-cava conservazione non è fattibile. L'occlusione totale della vena cava durante la fase di ricostruzione cava compromette la stabilità emodinamica del maiale. Anche se alcuni rapporti indicano che suina OLTx può essere eseguita durante totale cava e l'occlusione della vena porta inferiore a 25 min ^16,17, una tecnica di bypass porto-cava-giugulare per il tempo della ricostruzione vascolare è l'opzione più sicura e più pratico ^{7- 9,18.} In thesperienza e degli autori, un passivo porto-giugulare bypass non è ottimale per mantenere il emodinamicamente maiale stabile durante la fase anepatica. Il modello di bypass, compresa la decompressione attiva della cava sottoepatica e vena porta, permette una fase di ricostruzione tranquillità delle anastomosi cavali e portale sovraepatiche anche con il tempo di bloccaggio prolungato a causa di complicazioni impreviste. Contrariamente alle precedenti relazioni ^7, una splenectomia non è obbligatoria quando il catetere portale di bypass viene rimosso. Sia splenica e la vena sono chiusi a metà circa la lunghezza della milza lasciando la metà prossimale sufficientemente perfusione. Complicazioni come sanguinamento o embolia gassosa a causa di bypass disconnessione sono evitabili, garantendo che il bypass è posizionato accuratamente e fissato correttamente.

In sopravvivenza OLTx esperimenti a lungo termine, l'anastomosi dotto biliare è considerato un punto debole a causa del suo alto tasso di complicanze ^19. Il tessuto biliare è molto fragile e needs particolare attenzione quando viene gestita. Molte tecniche di anastomosi diverse sono state descritte ^5,19. Una anastomosi end-to-end è tecnicamente facile e associata a complicazioni minime ^19. Una sutura continuo con un ago non tagliente comprese grandi sezioni di tessuto connettivo peribiliare sembra essere superiore ad una sutura interrotta. Il dotto biliare è posto sotto tensione inutile quando i singoli punti di sutura interrotta sono annodati. Ciò può causare rotture del tessuto e perdite biliari consecutivi. Il materiale di sutura – riassorbibili o non riassorbibili – di solito non è importante, data la sua durata limitata fino a quando il maiale è terminata. Per i modelli di sopravvivenza a lungo termine nell'arco di diversi mesi, suture assorbibili – come in OLTx umano – sono preferibili.

Particolare attenzione deve essere presa con il post-operatorio di follow-up. Nutrizione sufficiente e alimentazione del fluido, un protocollo di sollievo dal dolore affidabile, e una adeguata immunosoppressioneregime sono obbligatori. Per gli esperimenti a lungo termine, l'immunosoppressione appare particolarmente importante. Rispetto ad altri mammiferi, i maiali mostrano sorprendentemente basso tasso di rigetto immunologico dopo OLTx ^20,21. Infiltrazioni di cellule rotonde sono la massima durante la seconda settimana dopo il trapianto e diminuiscono spontaneamente anche senza immunosoppressione. Il rifiuto è raramente la causa di morte dopo suina OLTx ^22. Tuttavia, anche con il protocollo di immunosoppressione coinvolge la somministrazione di steroidi iv e inibitori della calcineurina po accennato qui, il rigetto del trapianto è indicato da un lieve aumento delle transaminasi a partire da circa 4 giorni dopo OLTx e confermato dal campo apparente portale infiltrazione di cellule turno. Gli inibitori della calcineurina può essere somministrato sia po ^23,24 o IV ^25,26; Entrambi i metodi hanno svantaggi. Anche con ausili applicativi orali, l'importo effettivo raggiungimento del tratto gastro-intestinale resta sfuggente. D'altra parte, iv infusione continua inpenna di un maiale con un animale attivo è difficile. Pertanto, l'applicazione iv deve essere effettuata come un bolo, che si traduce in picchi di concentrazione elevata farmaco con potenziali effetti tossici. Tuttavia, entrambi i metodi di applicazione sembrano permettere la sopravvivenza a lungo termine.

Simile a un contesto clinico, si raccomanda la profilassi post-operatorio di stress ulcera. Sanguinamento post-operatorio da ulcere peptiche è un problema frequente e può essere correlata a una funzione epatica ^27. Dopo un paio di casi di sanguinamento gastrointestinale in entrambi i gruppi OLTx, gli autori hanno iniziato la profilassi regolari con pantoprazolo e non hanno avuto alcun sanguinamento gastrointestinale da allora.

Rigoroso mantenimento delle condizioni di sterilità intraoperatoriamente, paragonabili a quelle previste in una sala operatoria clinica, e conseguenti profilassi antibiotica, diminuisce il rischio di complicanze infettive.

In conclusione, questo articolo provides informazioni pratiche per la creazione di un programma di suino OLTx in un ambiente di ricerca. Sufficiente dedizione, pratica, e lavoro di squadra è importante al fine di diminuire il periodo di apprendimento, per produrre risultati affidabili, e per ridurre i costi e il numero di animali di ricerca.

Materials

Atropine Sulphate 15mg/30mL	Rafter 8 Products	238481
Buprenorphine 0.3mg/mL	RB Pharmaceuticals LDT	N/A
Cefazolin 1g	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2237138
Cyclosporin Oral Solution 5000mg/50mL	Novartis Pharmaceuticals Canada Inc.	2150697
Fentanyl Citrate 0.25mg/5mL	Sandoz Canada Inc.	2240434
Heparin 10,000iU/10mL	Leo Pharma A/S	453811
Isoflurane 99.9%, 250mL	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2231929
Ketamine Hydrochloride  5000mg/50mL	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	612316
Lactated Ringer’s + 5% Dextrose, 0.5L	Baxter Corporation	61131
Lacteted Ringer’s, 1L	Baxter Corporation	61085
Metronidazole 500mg/100mL	Baxter Corporation	870420
Midazolame 50mg/10mL	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2242905
Pantoprazole 40mg	Sandoz Canada Inc.	2306727
Potassium Chloride 40mEq/20mL	Hospira Healthcare Corporation	37869
Propofol 1000mg/100mL	Pharmascience Inc.	2244379
Protamine Sulfate 50mg/5mL	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2139537
Saline 0.9%, 1L	Baxter Corporation	60208
Sodium Bicarbonate 50 mEq/50mL	Hospira Healthcare Corporation	261998
Solu-Medrol 500mg	Pfizer Canada Inc.	2367963
Tranexamic Acid 1000mg/10mL	Pfizer Canada Inc.	2064413
University of Wisconsin Solution, SPS-1	Organ Recovery Systms	SPS-1
Xylocaine Endotracheal 10mg/50mL	AstraZeneca	2003767
Appose ULC 35W skin stapler	Covidien Canada	803712
Maxon, 1	Covidien Canada	606173
Sofsilk, 0	Covidien Canada	S606
Sofsilk, 2-0	Covidien Canada	S405
Sofsilk, 3-0	Covidien Canada	S404
Surgipro II, 4-0	Covidien Canada	VP581X
Surgipro II, 5-0	Covidien Canada	VP725X
Surgipro II, 6-0	Covidien Canada	VP733X
Catheter i.v, 18 G	BD Canada	381147
Cook TPN catheter, 9.5Fr	Cook Medical Company	C-TPNS-9.5-90
PSI Kit for sheath catheter, 8.5Fr	Arrow International	ASK-09803-UHN
Infusion Pump Line	Smith Medical ASD Inc.	21-0442-25
Liver Admin Set (flush line)	CardioMed Supplies Inc	17175
Mallinckrodt, Tracheal Tube, 6.5mm	Covidien Canada	86449
Med-Rx Suction Connecting Tube	Benlan Inc.	70-8120
Organ Bag	CardioMed Supplies Inc	2990
Suction Tip	Tyco Healthcare Group LP	8888501023
Valleylab, Cautery Pencil	Covidien Canada	E2515H
Valleylab, Patient Return Electrode	Covidien Canada	E7507
Bypass Connector 3/8” x 1/4“	Raumedic AG	955083-001
Bypass Connector 3/8” x 3/8” Luer Lock	Raumedic AG	955163-001
Bypass Connector Y 3/8” x 3/8” x 1/4”	Raumedic AG	961360-002
Bypass Tubing 1/4” x 1/16”	Raumedic AG	039505-010
Bypass Tubing 3/8” x 3/32”	Raumedic AG	039535-005
Rotaflow Cenrtifugal Pump	Maquet-Dynamed	HC 2821
Stainless Steel Hose Clamp Ring, 5mm	Oetiker	16700007
Abdominal Retractor	Medite GmbH	N/A
De Bakey – Beck, Infrahepatic Cava Clamp	Aesculap Inc.	FB519R
Diethrich, Atraumaitc Clamp (Portal Vein)	Aesculap Inc.	FB525R
Gregory Bull Dog Clamp, curved	Aesculap Inc.	FB382R
Gregory Bull Dog Clamp, straight	Aesculap Inc.	FB381R
Potts – De Martel, Scissors	Aesculap Inc.	BC648R
Satinsky, Suprahepatic Cava Clamp	Aesculap Inc.	FB605R
Symetrical Tubing Clamp	Codman Instruments	198010
Anesthesia Machine, Optimax	Moduflex Anesthesia Equipment	SN5180
Bypass Flow meter, HT 110	Transonic Systems Inc.	HT110B11106
Flow meter probe, H6XL	Transonic Systems Inc.	H6Xl689
Heat Therapy Pump, T/Pump	Gaymar Industries Inc	TP500-G89D19
Infusion Pump 3000	SIMS Graseby LTD.	SN300050447
Isoflurane Vapor 19.1	Draeger Medical Canada Inc.	N/A
Monitor, Datex AS 3	Instrumentarium Corp./ Hitachi	D-VHC14-23-02
Rotaflow Centrifugal Drive Unit	Marquet-Dynamed	952301
Rotaflow Console	Marquet-Dynamed	706035
Temperature Therapy Pad	Gaymar Industries Inc	TP26E
Valleylab Force Tx	Valleylab Inc.	216151480
Ventilator, AV 800	DRE Medical Equipment	40800AVV
Warm Touch, Patient Warming System	Nellcor/ Covidien Canada	5015300A