مسامية السيليكون المجهرية الدقيقة لتسليم سيرنا التداوي
Summary
لا يزال تقديم التحدي الرئيسي لتنفيذ العلاجي من الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا). ويشمل هذا البروتوكول استخدام منصة متعددة الوظائف وحيويا تسليم سيرنا، ويتألف من أرجينين وpolyethylenimine المطعمة المجهرية الدقيقة السيليكون التي يسهل اختراقها.
Abstract
Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.
Introduction
الرنا التدخل صغيرة (الرناوات siRNAs) هي عبارة عن جزيئات RNA المزدوج تقطعت بهم السبل التي يمكن أن قمع التعبير عن الجينات. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت الرناوات siRNAs كما جيل جديد من biodrugs التي تظهر الإمكانات العلاجية لاستخدامها في المستقبل في التطبيقات السريرية 1-5. ومع ذلك، لا يزال التنفيذ الناجح لعلاج سيرنا تحديا كبيرا، نظرا لتدهور كتبها nucleases، وسوء امتصاص الخلايا، وانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن والإفراج غير فعالة من دخلول؛ جسيم داخلي / يحلول 5. العديد من هذه العقبات يمكن التغلب عليها من خلال تطوير المنصات التسليم، والتي يمكن بأمان وكفاءة تقديم سيرنا إلى الأنسجة المريضة. مقارنة ناقلات فيروسية، والمنصات غير الفيروسية وتوفر العديد من المزايا، مثل السلامة، وانخفاض التكلفة وسهولة الخياطة. ولا سيما النانوية الموجبة، مثل البوليمرات والدهون، قد أثبتت جدواها لتسليم سيرنا 3.
سابقا، وقد وضعنا الدكتور قريصيميكروغرام نظام التسليم، ويسمى متجه متعدد المراحل (MSV). ويستند هذا البرنامج على مراحل متتابعة، والتي يتم تحريرها مركبة واحدة من آخر. أول مركبة المرحلة هي microparticle مصنوعة من السيليكون التي يسهل اختراقها قابلة للتحلل (PSI)، في حين أن المرحلة الثانية هي المركبات النانوية محملة المخدرات أو عوامل التباين 6،7. النانوية، والتي هي جزء لا يتجزأ في المواد PSI، يتم الافراج تدريجيا كما يحط سي 8. وهناك فائدة من استخدام جزيئات سي هي أن التشكل والسطحية الخصائص يمكن بسهولة أن تصمم لتحقيق biodistribution الأمثل والافراج عن المخدرات. في الآونة الأخيرة، وقد تبين نجاح استخدام منصة MSV لإيصال الجسيمات الشحمية سيرنا إلى نسيج الورم في المبيض وسرطان الثدي نموذج الفأر 9 و 10.
في هذا العمل، ونحن قد ملفقة نظام تسليم العالمي لسيرنا على أساس مبادئ منصة MSV. وقد سبق أظهرت لنا مدى فعالية هذا النظام تسليمجي سيرنا مختلف الجزيئات 11. هذا النظام هو السيليكون التي يسهل اختراقها (PCPS) الناقل بين functionalized polycation، ويتألف من PSI المطعمة مع polyethylenimine (PEI) وأرجينين (الارجنتين). PEI يمكن أن تساعد في تشكيل التفاعلات كهرباء مع سيرنا، بينما الارجنتين والمبادرة يمكن أن تكون لتقليل سمية PEI، كما demonstarted سابقا 11. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن وجود PEI تساعد في امتصاص الخلايا وendosomal الهروب، في حين أن المجهرية الدقيقة المبادرة تتيح حماية سيرنا وإطلاق المستدام. الجسيمات PSI تتحلل تدريجيا تحت الظروف الفسيولوجية، مما يؤدي إلى تشكيل النانوية الارجنتين-PEI / سيرنا (الشكل 1)، والتي لها التشكل متميزة وتوزيع حجم الضيق 11. للحصول على تفاصيل بشأن استقرار النظام PCPS / سيرنا، يرجى الرجوع إلى الدراسة التي شين وآخرون. 11. هذه المنصة PCPS تختلف عن MSV التقليدية، منذ النانوية المرحلة الثانية لا بريسي البدايةالإقليم الشمالي في الناقل، ولكن تتشكل مع مرور الوقت كما يحط الناقل المرحلة الأولى-11، و 12. وقد تم تقييم كفاءة سيرنا تحميل الكفاءة، وسمية الخلايا والجينات إسكات النظام PCPS في المختبر. وقد تم قياس كفاءة ترنسفكأيشن باستخدام سيرنا ضد توسع الشعريات ترنح تحور (ATM) الجين الورمي، التي تشارك في إصلاح الحمض النووي 10. سابقا، وقد تبين قمع ATM لتقليل نمو الورم في نموذج سرطان الثدي 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لإيصال ناجحة وترنسفكأيشن من سيرنا إلى الخلايا. على وجه الخصوص، ويتحقق تسليم سيرنا باستخدام منصة متعددة الوظائف تتألف من جسيمات PSI-بين functionalized polycation. استخدام العلاج سيرنا لديها امكانات كبيرة، على سبيل المثال، علاج السرطان، والعديد من ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from Houston Methodist Research Institute, the National Natural Science Foundation of China (Nos., 21231007 and 21121061), the Ministry of Education of China (Nos., 20100171110013 and 313058), the National Basic Research Program of China (973 Program No. 2014CB845604), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company/Institution | Catalog Number | Comments/Description |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10X Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10 X Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1X solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1X |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blor |
| 6X TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent. | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (hight), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
- De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Rolland, A. Gene medicines: the end of the beginning. Adv Drug Deliv Rev. 57 (5), 669-673 (2005).
- Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61 (10), 850-862 (2009).
- Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109 (2), 259-302 (2009).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 129-138 (2009).
- Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141 (3), 320-327 (2010).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29 (3), 377-384 (2008).
- Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102 (10), 3540-3549 (2014).
- Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19 (7), 1806-1815 (2013).
- Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9 (9-10), 1799-1808 .
- Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7 (11), 9867-9880 (2013).
- Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35 (1), 423-431 (2014).
- Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267 (1), 44-53 (2010).
- Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19 (7), 1448-1455 (2008).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212 (3), 223-231 (1985).
- Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5 (11), 815-821 (2010).
