siRNAの治療を送達するための多孔質シリコンマイクロ粒子
Summary
配信は、低分子干渉RNA（siRNA）の治療的実施のための主要な課題である。このプロトコルは、アルギニン及びポリエチレンイミングラフト化多孔質シリコン微粒子からなる多機能性および生体適合性siRNA送達プラットフォームの使用を含む。
Abstract
Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.
Introduction
低分子干渉RNA（siRNA）は、遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖RNA分子である。近年では、siRNAは、臨床応用1-5将来の使用のための治療の可能性を示してbiodrugsの新世代として開発されている。しかし、siRNAの治療の成功の実装が原因ヌクレアーゼ、貧しい細胞内取り込み、低トランスフェクション効率およびエンドソーム/リソソーム5から非効率的なリリースによる分解に、かなりの課題である。これらの障害の多くは、安全かつ効率的に病変組織にsiRNAを送達することができ、配信プラットフォームの開発によって克服することができる。ウイルスのキャリアと比較して、非ウイルスプラットフォームは、安全性、低コスト、調整の容易さなどのいくつかの利点を提供する。特に、このようなポリマーおよび脂質などの陽イオン性ナノ粒子は、siRNA送達のために有用3が証明されている。
以前、我々は、円盤状のDRを開発したUG送達システム、多段ベクトル（MSV）と呼ばれる。このプラットフォームは、1つの車両が別のから解放されているシーケンシャルな段階に基づいている。第二段目の車両が薬物または造影剤6,7を装填したナノ粒子である一方、第段階車両は、生分解性の多孔質シリコン（のpSi）から作られたマイクロ粒子である。 Siは8を分解するのpSi材料に埋め込 まれたナノ粒子は、徐々に放出される。 Si粒子を使用する利点は、形態および表面特性を容易に最適な生体内分布および薬物放出を達成するように調整することができることである。最近、腫瘍組織へのsiRNAのリポソームの送達のためのMSVプラットホームの使用の成功は、卵巣癌および乳癌のマウスモデル9、10に示した。
本研究では、MSVプラットフォームのプリンシパルに基づいてsiRNAのための普遍的なデリバリーシステムを作製した。この送達システムの有効性は、以前に我々を実証されている異なるsiRNA分子11をる。システムは、ポリエチレンイミン（PEI）およびアルギニン（Argで）でグラフトされたpSiからなる、ポリカチオン官能化多孔質シリコン（PCPS）担体である。以前に11 demonstartedとしてArgおよびのpSiが、PEIの毒性を減少するために役立つことができるが、PEIは、siRNAとの静電相互作用を形成するのを助けることができる。のpSi微粒子がsiRNAの保護と持続的な放出を可能にしながら、また、PEIの存在は、細胞内取り込みとエンドソーム脱出を支援することができます。のpSi粒子が徐々に異なる形態および狭いサイズ分布11を有しているのArg-PEI / siRNAのナノ粒子（ 図1）の形成をもたらす、生理学的条件下で分解する。 PCPS / siRNAのシステムの安定性に関する詳細については、シェンらの研究を参照してください。11。第二段階のナノ粒子は最初にpresaの複数形ではないので、このPCPSプラットフォームは、従来のMSVとは異なるntのキャリアであるが、第一段階キャリヤ11は、12を劣化させるような時間をかけて形成されている。PCPSシステムのsiRNA積載効率、細胞毒性および遺伝子サイレンシング効率は、 インビトロで評価されている。トランスフェクション効率は、DNA修復10に関与する突然変異した毛細血管拡張性運動失調（ATM）癌遺伝子に対するsiRNAを用いて測定した。以前に、ATMの抑制は乳癌モデル10における腫瘍増殖を減少させることが示されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、細胞へのsiRNAの配信の成功とトランスフェクションのための方法を説明します。具体的には、siRNAの送達は、カチオン官能化されたpSi粒子からなる多機能プラットフォームを使用することによって達成される。様々な癌遺伝子は高い特異性で標的化することができるようにするsiRNA療法の使用は、大きな可能性、 例えば 、癌治療を有する。したがって、siRNAの治療の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from Houston Methodist Research Institute, the National Natural Science Foundation of China (Nos., 21231007 and 21121061), the Ministry of Education of China (Nos., 20100171110013 and 313058), the National Basic Research Program of China (973 Program No. 2014CB845604), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company/Institution | Catalog Number | Comments/Description |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10X Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10 X Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1X solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1X |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blor |
| 6X TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent. | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (hight), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
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