Poreuze Silicon Micropartikels voor Levering van siRNA Therapeutics

Summary

Levering blijft de belangrijkste uitdaging voor de therapeutische toepassing van kleine interfererende RNA (siRNA). Dit protocol omvat het gebruik van een multifunctionele en biocompatibele siRNA afleverplateau, bestaande uit arginine en polyethyleenimine geënte poreuze silicium microdeeltjes.

Abstract

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Introduction

Kleine interfererende RNA's (siRNA's) zijn dubbelstrengs RNA-moleculen die de expressie van genen onderdrukken. De laatste jaren zijn siRNAs ontwikkeld als een nieuwe generatie biodrugs die therapeutisch potentieel voor toekomstig gebruik vertonen in klinische toepassingen ^1-5. Echter, de succesvolle implementatie van siRNA therapie blijft een grote uitdaging, als gevolg van afbraak door nucleasen, slechte intracellulaire opname, lage transfectie-efficiëntie en inefficiënt vrijlating uit de endosoom / lysosoom ^5. Veel van deze hindernissen kunnen worden overwonnen door de ontwikkeling van platforms, die veilig en efficiënt leveren siRNA zieke weefsel. Vergeleken met virale dragers, niet-virale platforms aantal voordelen, zoals veiligheid, lage kosten en het gemak van maatwerk. Vooral kationische nanodeeltjes, zoals polymeren en lipiden zijn nuttig voor siRNA levering ³ bewezen.

Eerder hebben we een schijfvormige dr ontwikkeldug levering systeem, genaamd de meertraps vector (MSV). Dit platform is gebaseerd op opeenvolgende fasen, waarbij één voertuig vrijkomt uit andere. De eerste fase voertuig een microdeeltje gemaakt van biologisch afbreekbaar poreus silicium (psi), terwijl de tweede fase voertuigen nanodeeltjes geladen geneesmiddelen of contrastmiddelen ^6,7. De nanodeeltjes die zijn ingebed in het ontvangende materiaal geleidelijk vrijgegeven als de Si degradeert ^8. Een voordeel van het gebruik Si deeltjes is dat de morfologie en oppervlaktekenmerken gemakkelijk kan worden aangepast om optimale biologische verdeling en geneesmiddelafgifte te bereiken. Onlangs heeft het succesvolle gebruik van de MSV platform voor de levering van siRNA liposomen tumorweefsel werd voorgesteld in een eierstok- en borstkanker muismodel ^{9, 10.}

In dit werk hebben we een universeel systeem voor de siRNA gebaseerd op de principes van de MSV-platform gefabriceerd. De werkzaamheid van dit afgiftesysteem eerder is ons geblekening verschillende siRNA moleculen ^11. Het systeem is een polykation gefunctionaliseerd poreus silicium (PCPS) drager, bestaande uit psi geënt met polyethyleenimine (PEI) en arginine (Arg). PEI kan helpen bij het ​​vormen van elektrostatische interacties met siRNA, terwijl Arg en PSI kan dienen om de toxiciteit van PEI verminderen, zoals eerder demonstarted ^11. Bovendien kan de aanwezigheid van PEI helpen bij intracellulaire opname en endosomale ontsnapping, terwijl psi microdeeltjes mogelijk siRNA bescherming en aanhoudende afgifte. De psi deeltjes geleidelijk afgebroken onder fysiologische omstandigheden, hetgeen resulteert in de vorming van Arg-PEI / siRNA nanodeeltjes (figuur 1), die een afzonderlijk morfologie en een nauwe grootteverdeling ¹¹ hebben. Voor details met betrekking tot de stabiliteit van de PCPS / siRNA-systeem, verwijzen wij u naar de studie van Shen et al. ^11. Dit PCPS platform verschilt van de conventionele MSV, sinds de tweede fase nanodeeltjes worden in eerste instantie niet present in de drager, maar worden gevormd over de tijd als de eerste fase drager afbreekt ^{11, 12.} siRNA beladingsrendement, cytotoxiciteit en silencing efficiëntie van het PCPS systeem is geëvalueerd in vitro. Transfectie-efficiëntie werd gemeten met siRNA tegen ataxia telangiectasia gemuteerde (ATM) oncogen, dat betrokken is bij DNA-herstel ^10. Eerder heeft de onderdrukking van ATM aangetoond tumorgroei afnemen in een borstkankermodel ^10.

Protocol

1. PCPS Particle Voorbereiding Oxideren niet- gefunctionaliseerde poreuze silicium deeltjes in een oplossing van waterstofperoxide met 30% bij 95 ° C gedurende 2 uur. Aminate de geoxideerde deeltjes in 2% (3-aminopropyl) triethoxysilaan oplossing in isopropylalcohol gedurende 2 dagen bij 65 ° C onder zacht roeren. Centrifugeer de oplossing gedurende 30 min bij 18.800 xg en was de deeltjes tweemaal in isopropanol en driemaal in ethanol, met korte sonicatie om de pellet te schorten. Laat de deeltjes…

Representative Results

Dit protocol beschrijft het gebruik van een niet-viraal afgiftesysteem voor veilige en efficiënte siRNA transfectie. De SEM resultaten blijkt dat de PCPS deeltjes cilindrisch van vorm en hebben een diameter van 2,6 urn (figuur 2A). De deeltjes zijn positief geladen bij een zeta-potentiaal van ongeveer 8,21 (figuur 2B), waardoor het mogelijk elektrostatische binding met negatief geladen nucleotiden. Confocale beelden van verschillende lagen van de PCPS deeltjes aantonen dat fluoresceren…

Discussion

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de succesvolle levering en transfectie van siRNA in cellen. In het bijzonder wordt de afgifte van siRNA gemaakt van een multifunctioneel platform bestaande uit gefunctionaliseerde psi polykation deeltjes. Het gebruik van siRNA therapie groot potentieel, zoals kankerbehandeling, diverse oncogenen kan worden gericht met een hoge specificiteit. Derhalve bestaat er behoefte aan siRNA bestelwagens ontwikkelen die de uitdagingen van siRNA therapie verminderen. Tot slot hebbe…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company/Institution	Catalog Number	Comments/Description
Polyethylenimine (PEI), branched	Sigma-Aldrich	408727	Average molecular weight ~25,000 Da
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Reagent grade, ≥98%
Boc-Asp-OH	Sigma-Aldrich	408-468	99%
(3-​Aminopropyl)​triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	99%
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	30 wt. % in H2O
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741	100.00%
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907	≥99.7%
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	≥99.5%
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	Sigma-Aldrich	03449	≥99%
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A7030-10G	Blocking agent
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA	Sigma-Aldrich		Designed in-house
Tris Acetate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T9650	For DNA agarose gel electrophoresis
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379	Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250	For Western blot
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71496	For making phosphate buffer
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640	For making phosphate buffer
Anti-Mouse IgG	Sigma-Aldrich	A4416	Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot
N-Hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	130672	98%
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid	Greiner Bio-One	655182	96-well plate
10X Tris-Glycine Liquid	Li-Cor	928-40010	Transfer buffer for Western blot
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz	Sc-281692	Fixation of cells
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G5421	Proliferation assay
Phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP399-500	10 X Solution
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.)	Fisher Scientific	MT-15-017-CM	Cell culture media, 1X solution
Triton X-100	Fisher Scientific	AC21568-2500	Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent
Cover glass	Fisher Scientific	12-530C
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	For Western blot transfer buffer
Plastic Cuvettes	Fisher Scientific	14-377-010	For size measurements using Zetasizer Nano ZS
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant	Fisher Scientific	14-754-34	Spray for removing RNAse contamination
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low melting point, for running RNA samples
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Antifade reagent with DAPI, nucelus detection
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	Visualization of RNA
Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Control siRNA
AllStars Neg. siRNA AF 555	Qiagen	1027294	Fluorescent control siRNA
Cell scraper	Celltreat	229310
BioLite Multidishes and Microwell Plates	Thermo Scientific	130184	6-well plate
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X)	Thermo Scientific	84788	Sample loading buffer for Western blot
Pierce BCS Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227	Protein quantification assay
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X)	Thermo Scientific	78430	Protease inhibitor cocktail, use at 1X
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Protein extraction reagent
Sorvall Legend Micro 21R	Thermo Scientific	75002440	Centrifuge
Beta Actin Antibody	Thermo Scientific	MA1-91399	β-actin primary antibody (from mouse) for western blor
6X TriTrack DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R1161	DNA loading dye
Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9938
Non-Fat Dry Milk	Lab Scientific	M0841	For Western blot
2-well BD Falcon culture slides	BD Biosciences	354102	2-well culture slides
Amersham ECL Western blot detection reagent.	GE Healthcare Life Sciences	RPN2106	Western blot detection reagent
BA Membranes	GE Healthcare Life Sciences	10402096	Nitrocellulose membrane for Wester blot
ATM (D2E2) Rabbit mAb	Cell Signaling	2873S	ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074	Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot
Folded capillary cells	Malvern	DTS 1061	For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS
MDA-MB-231 cell line	ATCC	HTB-26	Mammary Gland/Breast
12% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-rad	456-1043	For Western blot
Biorad PowerPac HC	Bio-rad	164-5052	Power supply for electrophoresis
10x Tris/Glycine/SDS Buffer	Bio-rad	161-0732	Running buffer for Western blot
Wide Mini-Sub Cell GT Cell	Bio-rad	170-4405	Electrophoresis equipment for DNA agarose gel
Mini-PROTEAN Tetra cell	Bio-rad	165-8000	Electrophoresis equipment for Western blot
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software	Bio-rad	170-8265	Image acquisition and analysis software for gels and blots
4" (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer	Ted Pella	16007	Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy
Thermomixer R	Eppendorf	22670107	Shaker
Isoton II diluent	Beckman Coulter	8546719	Isoton diluent
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076	Particle counting analyzer
Non-functionalized porous silicon particles	Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin		Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (hight), provided in isopropyl alcohol
Zetasizer Nano ZS	Malvern		Particle analyzer system for size and zeta potential
Scanning Electron Microscope	FEI		Particle size and shape
Atomic Force Microscope	Bruker		Particle size and shape
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope	Olympus		Visualization of fixed and live cells