Porøs Silicon Mikropartikler for levering av siRNA Therapeutics

Summary

Levering er fortsatt den viktigste utfordringen for den terapeutiske gjennomføring av små RNA forstyrrende (siRNA). Denne protokollen innbefatter bruken av en multifunksjonell og biokompatibelt siRNA levering plattform, bestående av arginin og polyetylenimin podet porøse silisium mikropartikler.

Abstract

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Introduction

Små interfererende RNA (sirnas) er dobbelt-RNA-molekyler som kan undertrykke uttrykket av gener. I de senere årene har sirnas blitt utviklet som en ny generasjon av biodrugs som viser terapeutisk potensial for fremtidig bruk i kliniske applikasjoner ^1-5. Men fortsatt er vellykket implementering av siRNA terapi en betydelig utfordring, på grunn av nedbrytning av nukleaser, dårlig intracellulære opptaket, lav transfeksjonseffektivitet og ineffektiv utgivelse fra endosomet / lysosomet ^5. Mange av disse hindringer kan overvinnes ved utvikling av levering plattformer, som sikkert og effektivt kan levere siRNA til sykt vev. Sammenlignet med virusbærere, ikke-virale plattformer gir flere fordeler, for eksempel sikkerhet, lave kostnader og enkel skreddersøm. Spesielt kationiske nanopartikler, så som polymerer og lipider, har vist seg nyttig for siRNA levering ^3.

Tidligere har vi utviklet en skiveformede drug leveringssystem, betegnet flertrinns vektor (MSV). Denne plattformen er basert på sekvensielle trinn, hvor ett kjøretøy er frigjort fra hverandre. Det første trinn kjøretøy er en mikropartikkel laget av biologisk nedbrytbare porøse silisium (PSI), mens den andre fasen kjøretøyer er nanopartikler ladet med medikamenter eller kontrastmidler ^6,7. Nanopartikler, som er innebygd i PSI materiale, er gradvis utgitt som Si degraderer ^8. En fordel med å bruke Si partikler er at morfologi og overflateegenskaper kan enkelt tilpasses for å oppnå optimal biodistribusjon og narkotika utgivelse. Nylig ble den vellykkede bruk av MSV-plattform for levering av siRNA liposomer til tumorvevet vist i en ovarian og brystkreft musemodell ^{9, 10.}

I dette arbeidet har vi fabrikkert en universell levering system for siRNA basert på prinsippene i MSV-plattformen. Effekten av dette avgivelsessystemet har tidligere blitt demonstrert ossing forskjellig siRNA molekyler ^11. Systemet er et polykation-funksjonalisert porøs silisium (PCPS) bærer, som består av PSI podet med polyetylenimin (PEI) og arginin (Arg). PEI kan hjelpe til å danne elektrostatiske interaksjoner med siRNA, mens Arg og PSI kan tjene til å redusere giftigheten av PEI, som tidligere demonstarted ^11. I tillegg kan tilstedeværelsen av PEI bistå i intracellulært opptak og endosomale flukt, mens psi mikropartikler mulig siRNA beskyttelse og forlenget frigivelse. PSI partiklene gradvis nedbrytes under fysiologiske betingelser, for derved å resultere i dannelsen av Arg-PEI / siRNA nanopartikler (figur 1), som har en distinkt morfologi og en smal størrelsesfordeling ^11. For detaljer om stabiliteten i PCPS / siRNA system, henvises til studiet av Shen et al. ^11. Dette PCPS plattformen skiller seg fra konvensjonell MSV, siden de andre scenenanopartikler ikke er i utgangspunktet present i transportøren, men dannes over tid som første-trinns bærer degraderer ^{11, 12.} Den siRNA lasteeffektivitet, cytotoksisitet og genet stanse effektiviteten av PCPS systemet har blitt evaluert in vitro. Transfeksjonseffektiviteten ble målt ved hjelp av siRNA mot ataxia telangiectasia mutated (ATM) onkogen, som er involvert i DNA-reparasjon ^10. Tidligere har undertrykkelse av ATM blitt vist å redusere tumorvekst i en brystkreftmodell ^10.

Protocol

1. PCPS Particle Forberedelse Oksydere ikke-funksjonaliserte porøse silisiumpartikler i en 30% oppløsning av hydrogenperoksyd ved 95 ° C i 2 timer. Aminere de oksyderte partikler som i 2% (3- aminopropyl) trietoksysilan løsning i isopropylalkohol i 2 dager ved 65 ° C med forsiktig omrøring. Sentrifuger løsningen i 30 minutter ved 18800 xg og vaske partiklene to ganger i isopropylalkohol og tre ganger i etanol, ved hjelp av korte ultralydbehandling for å suspendere pelleten. La partiklene i e…

Representative Results

Denne protokollen beskriver anvendelsen av et ikke-virale leveringssystem for sikker og effektiv siRNA transfeksjon. SEM-resultater viser at de PCPS partiklene er sylindrisk i form og har en diameter på 2,6 um (figur 2A). Partiklene blir positivt ladet med et zeta potensial på omtrent 8,21 (figur 2B), for derved å muliggjøre elektrostatisk binding med negativt ladede nukleotider. Konfokale bilder av forskjellige lag av PCPS partiklene viser at fluorescerende kontroll siRNA er lagt i…

Discussion

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for en vellykket levering og transfeksjon av siRNA inn i celler. Spesielt er levering av siRNA oppnås ved hjelp av en multifunksjonell plattform bestående av polykation-funksjonalisert psi partikler. Bruk av siRNA terapi har stort potensial, for eksempel, kreftbehandling, som ulike onkogener kan være målrettet med høy spesifisitet. Derfor er det et krav om å utvikle siRNA levering kjøretøy, noe som kan redusere utfordringene i siRNA terapi. Avslutningsvis ha…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company/Institution	Catalog Number	Comments/Description
Polyethylenimine (PEI), branched	Sigma-Aldrich	408727	Average molecular weight ~25,000 Da
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Reagent grade, ≥98%
Boc-Asp-OH	Sigma-Aldrich	408-468	99%
(3-​Aminopropyl)​triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	99%
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	30 wt. % in H2O
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741	100.00%
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907	≥99.7%
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	≥99.5%
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	Sigma-Aldrich	03449	≥99%
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A7030-10G	Blocking agent
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA	Sigma-Aldrich		Designed in-house
Tris Acetate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T9650	For DNA agarose gel electrophoresis
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379	Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250	For Western blot
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71496	For making phosphate buffer
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640	For making phosphate buffer
Anti-Mouse IgG	Sigma-Aldrich	A4416	Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot
N-Hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	130672	98%
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid	Greiner Bio-One	655182	96-well plate
10X Tris-Glycine Liquid	Li-Cor	928-40010	Transfer buffer for Western blot
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz	Sc-281692	Fixation of cells
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G5421	Proliferation assay
Phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP399-500	10 X Solution
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.)	Fisher Scientific	MT-15-017-CM	Cell culture media, 1X solution
Triton X-100	Fisher Scientific	AC21568-2500	Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent
Cover glass	Fisher Scientific	12-530C
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	For Western blot transfer buffer
Plastic Cuvettes	Fisher Scientific	14-377-010	For size measurements using Zetasizer Nano ZS
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant	Fisher Scientific	14-754-34	Spray for removing RNAse contamination
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low melting point, for running RNA samples
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Antifade reagent with DAPI, nucelus detection
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	Visualization of RNA
Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Control siRNA
AllStars Neg. siRNA AF 555	Qiagen	1027294	Fluorescent control siRNA
Cell scraper	Celltreat	229310
BioLite Multidishes and Microwell Plates	Thermo Scientific	130184	6-well plate
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X)	Thermo Scientific	84788	Sample loading buffer for Western blot
Pierce BCS Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227	Protein quantification assay
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X)	Thermo Scientific	78430	Protease inhibitor cocktail, use at 1X
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Protein extraction reagent
Sorvall Legend Micro 21R	Thermo Scientific	75002440	Centrifuge
Beta Actin Antibody	Thermo Scientific	MA1-91399	β-actin primary antibody (from mouse) for western blor
6X TriTrack DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R1161	DNA loading dye
Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9938
Non-Fat Dry Milk	Lab Scientific	M0841	For Western blot
2-well BD Falcon culture slides	BD Biosciences	354102	2-well culture slides
Amersham ECL Western blot detection reagent.	GE Healthcare Life Sciences	RPN2106	Western blot detection reagent
BA Membranes	GE Healthcare Life Sciences	10402096	Nitrocellulose membrane for Wester blot
ATM (D2E2) Rabbit mAb	Cell Signaling	2873S	ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074	Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot
Folded capillary cells	Malvern	DTS 1061	For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS
MDA-MB-231 cell line	ATCC	HTB-26	Mammary Gland/Breast
12% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-rad	456-1043	For Western blot
Biorad PowerPac HC	Bio-rad	164-5052	Power supply for electrophoresis
10x Tris/Glycine/SDS Buffer	Bio-rad	161-0732	Running buffer for Western blot
Wide Mini-Sub Cell GT Cell	Bio-rad	170-4405	Electrophoresis equipment for DNA agarose gel
Mini-PROTEAN Tetra cell	Bio-rad	165-8000	Electrophoresis equipment for Western blot
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software	Bio-rad	170-8265	Image acquisition and analysis software for gels and blots
4" (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer	Ted Pella	16007	Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy
Thermomixer R	Eppendorf	22670107	Shaker
Isoton II diluent	Beckman Coulter	8546719	Isoton diluent
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076	Particle counting analyzer
Non-functionalized porous silicon particles	Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin		Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (hight), provided in isopropyl alcohol
Zetasizer Nano ZS	Malvern		Particle analyzer system for size and zeta potential
Scanning Electron Microscope	FEI		Particle size and shape
Atomic Force Microscope	Bruker		Particle size and shape
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope	Olympus		Visualization of fixed and live cells