Isolasjon og Funksjonell analyse av Mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Summary

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Abstract

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Introduction

Levende celler bank metabolsk energi i form av fett og karbohydrater, og bruke denne energien for biosyntese, membrantransport og bevegelse. Noe energi blir oppnådd i cytosol ved omdannelsen av diettsukker direkte til ATP under glykolyse. Imidlertid er hovedkilden for ATP produksjon i en celle utnyttes i mitokondriene via mitokondrie respiratoriske kjeden ^1. Arkitekturen i mitokondriene gir nødvendig romlig orientering for effektiv og effektiv ATP produksjon. Mitokondrier har en dobbelt membran adskilt med en intermembrane plass, og sammen med grunnmassen, den innerste mitokondrie rommet, huset komponentene og koordinere de kjemiske reaksjoner som er involvert i ATP generasjon. Den indre membran inneholder en serie av membranbundne proteinkomplekser som utgjør den respiratoriske kjeden samt ATP syntetase, proteinkompleks som bringer ADP og Pi sammen for dannelsen av ATP. Vertshuseter membranen er foldet til cristae og elektronene føres langs de respiratoriske kjeden komplekser via cytokrom c, et oppløselig elektronbærer som beveger seg mellom kompleksene innenfor intermembrane plass. Når elektronene beveger seg, oppstår oksydasjon av reduserende ekvivalenter og hydrogenioner blir pumpet fra matrisen til det intermembrane plass. Som en konsekvens av den høye ionekonsentrasjon i intermembrane plass, bygger en elektrokjemisk gradient som resulterer i en membran potensial over den indre mitokondrie-membran (Δψ) ^2. Oksygen er den avsluttende elektronakseptor for elektrontransportkjeden, og hydrogenioner strømme gjennom ATP synthases fra intermembrane plass tilbake til grunnmassen, og dermed direkte føre til ATP formasjonen. Denne prosessen som er beskrevet i sin helhet er kjent som oksydativ fosforylering. Foldene i cristae øke overflatearealet av den indre membranen, slik at for maksimal elektrontransport og ATP produksjon innenforhver mitokondrie. Proteiner, enzymer og andre molekyler som er involvert i oksidativ fosforylering er avledet fra både nukleære og mitokondrielle gener. Mitokondrier inneholde sin egen sirkulært DNA, som koder for 13 proteiner samt tRNA og mRNA som er nødvendige for ATP produksjon ^tre. Imidlertid er mange flere proteiner som kreves, og dermed er atom kodet. De fleste av disse atom-kodede proteiner er rettet mot den mitokondrielle matriks ved bruk av presequences ved N-terminalen av forløper-proteinet, og deres innførsel er drevet delvis av Δψ ^4,5.

Ut over å bidra til de Bioenergi i en celle, mitokondrier også påvirke viktige metabolske prosesser som TCA og beta-oksydasjon, cellesignalisering ved å regulere kalsium, samt en nøkkelrolle i apoptose ^6. Spesielt i tider med cellulært stress, BCL-2 familie proteiner som ligger på eller samhandle på mitokondrie ytre membran kan forårsake mitokondriellytre membran permeabilitet (MOMP) ^7,8. Under MOMP, er cytokrom c og andre proteiner frigjort i cytosol, og sammen med flere cytosoliske proteiner danner et kompleks kalt apoptosome ^9,10. Den apoptosome aktiverer kaspaser som går på å kløyve cellulære proteiner og DNA i gjennomføringsfasen av apoptose. Så snart MOMP skjer, er ΔΨ kollapset og ATP produksjonen stanset. Således, som apoptose initieres mitokondriefunksjon er kompromittert og endringer i ΔΨ kan korreleres til mitokondriell og celle helse ^12. Mens apoptose er et endepunkt i mange sykdomsmodeller, mitokondriefunksjon og endringer til ΔΨ kan også gi verdifull informasjon om sykdom opprinnelse og / eller progresjon. For eksempel har mitokondrie strukturelle og funksjonelle endringer er dokumentert i løpet av nevrodegenerative sykdommer ^13,14.

I den første del av protokollen, isoning av intakte mitokondrier som beholder sin ΔΨ er beskrevet. HEK-293T-celler ble eksponert for ulike konsentrasjoner og kombinasjoner av rekombinant TNF-α, IL1-β og IFN-γ å indusere apoptose. Disse cytokiner ble valgt fordi de ofte er rapportert å være høy i primære humane septik prøvene ¹⁵ og den ytre vei av apoptose kan utløses ved samvirke av TNF-α-binding til dets reseptor ^6. Siden det er små variasjoner er nødvendige for å isolere funksjonell mitokondrier fra primær vev sammenlignet med dyrkede celler, og fordi mye forskning utnytter dyr, protokollen beskriver også hvordan å isolere mitokondrier fra leveren og ryggmargen av fremre lateral sklerose (ALS) musemodell.

Den andre del av protokollen ble utviklet for å overvåke perturbasjoner i den mitokondrielle membranpotensialet ved hjelp av en potensialsensitive fluorescerende fargestoff med et fluorescerende plateleser. Forskjells mellom celle status (dvs. frisk vs. usunn) blir differensiert ved å kvantifisere styrken av ΔΨ av isolerte mitokondrier i forbindelse med frakoblingsmidler, respiratoriske kjede-inhibitorer, komplekse inhibitorer og ionoforer, som alle fører til bortledning av mitokondriemembranpotensialet. Den sunnere mitokondriene, jo større forandringen i ΔΨ ved behandling med mitokondrie-inhibitorer, derfor responsen til mitokondriene kan brukes som en indikator på mitokondrie (dys) funksjon.

Bruk av isolerte mitokondrier fremfor in situ vurdering av funksjonen gir definitive bevis på at en patologi eller behandling modulerer endringer i organeller ^{16 til 18} direkte. Mens det finnes metoder i litteraturen for å isolere mitokondrier fra dyrkede celler, er de vag ¹⁷ og / eller utbytte av spesialisert utstyr ^16. Denne protokollen beskriver i detalj isolering fremgangsmåte og erlett kan tilpasses til andre cellelinjer, inkludert primære vev og kulturer ^13,14,19,20. Mange isolerte mitokondrier studier utnytte de samme mitokondrielle uncouplers og hemmere brukes i denne protokollen, men med en Clark elektrode ⁽²¹ er et representativt eksempel på mange papirer i litteraturen), som igjen er en veldig spesifikk og spesialisert utstyr. Videre har denne tradisjonelle metode begrensninger som lav gjennomstrømning og høy kompleksitet ^22,23 og krever en betydelig mengde av mitochondria (~ 500 ug / reaksjon). I denne protokoll, blir det fluorescerende membransensor potensial probe TMRE brukes i forbindelse med en fluoriserende plateleser, som er en standard maskin i mange laboratorier. TMRE er ansett siden det raskt går celler og isolerte mitokondrier og kan anvendes ved lave konsentrasjoner ^24. Flere reaksjoner kan raskt settes opp i tandem og batch analysert ved bruk av denne protokollen. Videre er reaksjonens krever en mye mindre mengde av isolerte mitokondrier (~ 10 pg / reaksjon). Ved å kreve mindre materiale, kan mindre vevs- eller cellekulturprøver benyttes som et utgangspunkt for mitokondriene isolert, kan flere replikater eller reaksjoner settes opp, og potensielt nok materiale til andre isolerte mitokondrier eksperimenter slik som ATP produksjon, oksygenforbruk eller import assays er mulig.

Protocol

Alle dyreforsøk dannet National Institutes of Health retningslinjer og ble godkjent av Wake Forest University Animal Care og bruk komité. Hekkende par for SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] musemodell ble hentet fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Transgen villtype (WT) hunner og SOD1G93A hanner [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] ble avlet for å generere SOD1G93A mus og ikke-transgen WT kullsøsken som ble brukt i forsøkene. 1. Modeller for Investigation Cellekultur …

Representative Results

Behandling av HEK-293T-celler med 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, og 75 ng / ml IFN-γ (* 3) for 24 til 48 timer gir en progressiv mengder av celledød (figur 1A ). Cellenes levedyktighet ble bestemt ved hjelp av MTT-analyser og konsekvent viser at det er ~ 10% reduksjon i cellelevedyktighet med 24 timers behandling og ~ 20% reduksjon med 48 timers behandling. Celler ble behandlet med tilsvarende konsentrasjoner (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, og 75 ng / ml IFN-γ) ga lignende resultater …

Discussion

Behandling av HEK-293T-celler med rekombinante cytokiner forårsaker moderate mengder av celledød i løpet av 48 timer (figur 1). Mengden av celledød indusert av TNF-alfa behandlingen er lik tidligere rapporterte studiene ³⁰ og celleviabilitet avtar etter samtidig bruk av flere cytokiner som er større enn summative mengder med noen cytokin alene er også konsistent med litteraturen ^31,32. Muligheten til å justere mengder og typer av cytokin behandlinger samt sammenligning av co…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
L-glutamic acid	Sigma	G1251	Can use the potassium salt instead.
malic acid	Sigma	M8304	Can use the potassium salt instead.
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma base	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.
sucrose	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water
rotenone	Sigma	R8875	Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin	Sigma	O4876	Highly toxic. Made in ethanol.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.
DMEM	Gibco	11965-084	1x regular (high glucose).
Pen/Strep	Invitrogen	15140-155
L-glutamine	Fisher	SH3002101	Store aliquots at -20C
FBS	Lonza	14-501F	US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Protien Assay Dye (5x)	Bio-Rad	500-0006	Any protein assay can substitute.
BSA	Fisher	BP1600-100	Make 2mg/mL stock in water for protein assay.
MTT powder	Sigma	M2128	Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)	Sigma	NP40S
Recombinant Human IL-1B	Gibco	PCH08014	Once opened store aliquots at -20C
Recombinant Human TNF-alpha	Gibco	PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma	Gibco	PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit	R&D systems	DTC0	Human for HEK-293T cells.