Выделение и функциональный анализ митохондрий из культивируемых клеток и мышь ткани

Summary

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Abstract

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Introduction

Живые клетки банк метаболической энергии в виде жиров и углеводов и использовать эту энергию для биосинтеза, мембранного транспорта и движения. Часть энергии получают в цитозоле путем преобразования пищевых сахаров непосредственно в процессе гликолиза АТФ. Тем не менее, главным источником производства АТФ в клетке задействовать в митохондриях с помощью митохондриальной дыхательной цепи ^1. Архитектура митохондрий обеспечивает необходимую пространственную ориентацию для эффективного и действенного АТФ производства. Митохондрии обладают двойную мембрану, разделенные межмембранном пространстве, и вместе с матрицей, самой внутренней митохондриальной отсека, дом компонентов и координировать химических реакций, участвующих в ATP поколения. Внутренняя мембрана содержит ряд мембраносвязанных белковых комплексов, которые включают дыхательную цепь, а также АТФ-синтазы, белкового комплекса, который приносит АДФ и Pi вместе для образования АТФ. Гостиницаэ мембрана сложена в крист и электроны передаются по дыхательной цепи комплексов через цитохром С, растворимого электронного носителя, который движется между комплексами в пределах межмембранном пространстве. Как двигаться электроны, окисление восстанавливающих эквивалентов происходит, и ионы водорода закачивается из матрицы в межмембранном пространстве. Как следствие высокой концентрации ионов в межмембранном пространстве, электрохимического градиента создает в результате чего мембранного потенциала через внутреннюю мембрану митохондрий (Δψ) ^2. Кислород является окончательным акцептором электронов в цепи переноса электронов, а ионы водорода течь через синтазы АТФ из межмембранного пространства обратно в матрице, и при этом непосредственно вызвать образование АТФ. Этот процесс, как описано в целом известен как окислительного фосфорилирования. Складки крист увеличить площадь поверхности внутренней мембраны, что позволяет максимально электронного транспорта и производства АТФ вкаждый митохондрии. Белки, ферменты и другие молекулы, участвующие в окислительном фосфорилировании получены из обоих ядерных и митохондриальных генов. Митохондрии содержат свой ​​собственный кольцевой ДНК, кодирование для 13 белков, а также тРНК и мРНК, необходимых для производства АТФ ^3. Тем не менее, многие другие белки необходимы, и, таким образом, ядерная закодирован. Большинство из этих атомных кодируемых белков ориентированы в митохондриях по использованию presequences на N-конце белка-предшественника, и их импорта частично вызвано Δψ ^4,5.

За вклад в биоэнергетике клетки, митохондрии и влиять на основные метаболические процессы, такие как TCA и бета-окисления, клеточной сигнализации через регулирующего кальция, а также ключевую роль в апоптозе ^6. В частности, во время клеточного стресса, Bcl-2 белки семейства, которые находятся на или взаимодействовать в митохондриальной наружной мембраны может вызвать митохондриальнуюВнешняя проницаемость мембраны (MOMP) ^7,8. Во MOMP, цитохром с и другие белки высвобождаются в цитозоль, и вместе с несколькими цитозольных белков образуют комплекс под названием Апоптосома ^9,10. Апоптосома активирует каспазы, которые выходят на расщеплять клеточных белков и ДНК во время фазы выполнения апоптоза. Как только происходит MOMP, ΔΨ свернут и производство АТФ остановился. Таким образом, как апоптоза инициируется функции митохондрий нарушена, и изменения в ΔΨ могут быть соотнесены с митохондриальной и клеточной здоровья ^12. В то время как апоптоз конечная точка во многих моделях болезни, функции митохондрий и изменения ΔΨ также может дать ценную информацию о возникновении заболевания и / или прогрессирования. Например, митохондриальные структурные и функциональные изменения были зарегистрированы в ходе нейродегенеративных заболеваний ^13,14.

В первой части протокола, ISOтельства интактных митохондриях, которые сохраняют свою ΔΨ описано. НЕК-293Т клетки подвергали воздействию различных концентраций и комбинаций рекомбинантного TNF-α, β-IL1 и IFN-γ индуцировать апоптоз. Эти цитокины были выбраны потому, что они часто сообщалось, с высоким содержанием первичных проб человека септических ¹⁵ и внешнего пути апоптоза могут быть вызваны взаимодействием TNF-α с его рецептором ^6. Так есть тонкие различия, необходимые для выделения функционального митохондрии из первичных тканей по сравнению с культивируемых клеток, и из-за много исследований использует животных, протокол также описывает, как изолировать митохондрии из печени и спинного мозга передних боковой склероз (ALS) модель мыши.

Вторая часть протокола была разработана для мониторинга возмущений в митохондриальной мембране потенциала с использованием потенциал-чувствительный флуоресцентный краситель с флуоресцентным планшет-ридере. Разницас между сотовой статуса (например, по сравнению с здоровым здоровья) дифференцируются путем количественного прочность ΔΨ изолированных митохондрий в сочетании с разобщающих агентов, ингибиторов дыхательной цепи, сложные ингибиторов и ионофоров, все из которых вызывают диссипацию митохондриальной мембранного потенциала. Здоровыми митохондрии, тем больше изменение в ΔΨ при обработке митохондриальных ингибиторов, следовательно, реакция митохондрий могут быть использованы в качестве индикатора функции митохондрий (Dys).

Использование изолированных митохондриях, а не в месте оценки функции предлагает окончательное доказательство того, что патология или лечение непосредственно модулирует изменения в органелл ^16-18. Хотя существуют методы в литературе, чтобы изолировать митохондрии от культивируемых клеток, они являются неточными ¹⁷ и / или использовать специальное оборудование ^16. Этот протокол описывает в деталях метод изоляции имогут быть легко адаптированы к другим клеточных линий, в том числе первичной ткани и культур ^13,14,19,20. Многие изолированные митохондрии исследования используют одни и те же митохондриальной разобщители и ингибиторы, используемые в данном протоколе, но с электродом Кларка ⁽²¹ является типичным примером многих работах, описанных в литературе), что опять-таки является очень специфический и специализированный элемент оборудования. Кроме того, этот традиционный способ имеет недостатки, такие как низкая пропускная способность и высокой сложности ^22,23 и требует значительного количества митохондрий (~ 500 мкг / реакция). В этом протоколе, флуоресцентный мембраны зондирования потенциал TMRE зонд используют в сочетании с флуоресцентным планшет-ридере, который является стандартным машина во многих лабораторий. TMRE широко известен, поскольку он быстро проникает в клетку и изолированные митохондрии и может быть использован в низких концентрациях ^24. Несколько реакции может быть быстро создана в тандеме и партии анализируют с использованием этого протокола. Кроме того, реакцияс требуют много небольшое количество изолированных митохондрий (~ 10 мкг / реакция). К требует меньше материала, меньше, ткани или клеточной культуры образцы могут быть использованы в качестве отправной точки для изоляции митохондрий, более параллельных или реакции могут быть созданы, и достаточно потенциально материал для других изолированных экспериментах митохондрий, таких как производство АТФ, потребление кислорода, или импорта анализы возможно.

Protocol

Все эксперименты на животных соответствовала Национальных Институтов руководящих принципов Здоровья и были одобрены Wake Forest University Уход за животными и использование комитета. Гнездящихся пар для SOD1G93A [B6SJL-Тя (SOD1-G93A) 1Gur] мышиной модели были получены из лаборатории Джексона (Бар Харбор, ME). …

Representative Results

Лечение НЕК-293Т с 200 мкг / мл TNF-α, 40 нг / мл IL1-β, и 75 нг / мл IFN-γ (* 3) в течение 24-48 ч приводит к прогрессирующему количеств клеточной гибели (фиг.1А ). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ анализов и последовательно демонстрирует, что составляет ~ 10% снижение жизнеспособност?…

Discussion

Лечение НЕК-293Т с рекомбинантных цитокинов вызывает умеренное количество клеточной смерти в течение 48 ч (рис 1). Количество гибели клеток, индуцированной ФНО-альфа лечения аналогичен ранее опубликованных исследований ³⁰ и жизнеспособность клеток уменьшается после совме?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
L-glutamic acid	Sigma	G1251	Can use the potassium salt instead.
malic acid	Sigma	M8304	Can use the potassium salt instead.
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma base	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.
sucrose	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water
rotenone	Sigma	R8875	Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin	Sigma	O4876	Highly toxic. Made in ethanol.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.
DMEM	Gibco	11965-084	1x regular (high glucose).
Pen/Strep	Invitrogen	15140-155
L-glutamine	Fisher	SH3002101	Store aliquots at -20C
FBS	Lonza	14-501F	US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Protien Assay Dye (5x)	Bio-Rad	500-0006	Any protein assay can substitute.
BSA	Fisher	BP1600-100	Make 2mg/mL stock in water for protein assay.
MTT powder	Sigma	M2128	Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)	Sigma	NP40S
Recombinant Human IL-1B	Gibco	PCH08014	Once opened store aliquots at -20C
Recombinant Human TNF-alpha	Gibco	PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma	Gibco	PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit	R&D systems	DTC0	Human for HEK-293T cells.