Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Summary

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Abstract

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Introduction

Lebende Zellen Bank Stoffwechselenergie in Form von Fetten und Kohlenhydraten und die Nutzung dieser Energie für Biosynthese, Membrantransport und Bewegung. Etwas Energie wird in das Cytosol durch die Umwandlung von diätetischen Zuckern direkt in ATP während Glykolyse erhalten. Jedoch ist die Hauptquelle für die ATP-Produktion in einer Zelle, in die Mitochondrien über das mitochondriale Atmungskette ¹ genutzt. Die Architektur der Mitochondrien liefert die notwendige räumliche Orientierung für die effektive und effiziente Produktion von ATP. Mitochondrien besitzen ein Doppelmembran von einem Intermembranraum und zusammen mit der Matrix, dem innersten mitochondrialen Raum, Haus der Komponenten getrennt und zu koordinieren, die chemischen Reaktionen in ATP-Generation beteiligt. Die innere Membran enthält eine Reihe von membrangebundenen Proteinkomplexe der Atmungskette als auch die ATP-Synthase, den Proteinkomplex, ADP und Pi für die Bildung von ATP vereint umfassen. Das Gasthauser Membran in Cristae gefaltet und Elektronen entlang der Atmungskette Komplexe durch das Cytochrom c, einem löslichen Elektronenüberträger, die zwischen Komplexen im Intermembranraum bewegt sich übergeben. Elektronen bewegen, Oxidation von Reduktionsäquivalenten eintritt und Wasserstoffionen werden aus der Matrix in den Intermembranraum gepumpt. Als Folge der hohen Ionenkonzentration innerhalb des Intermembranraum, baut sich ein elektrochemischer Gradient was zu einem Membranpotential über die innere Mitochondrienmembran (Δψ) ^2. Sauerstoff ist das endgültige Elektronenakzeptor der Elektronentransportkette, und Wasserstoffionen strömen durch die ATP-Synthase aus dem Intermembranraum zurück in die Matrix und in so direkt tun ATP-Bildung führen. Das Verfahren in seiner Gesamtheit beschrieben wird als oxidative Phosphorylierung bekannt. Die Falten der Cristae vergrößern die Oberfläche der inneren Membran, so dass für maximale Elektronentransport und die ATP-Produktion imjedes Mitochondrium. Die Proteine, Enzyme und andere Moleküle in der oxidativen Phosphorylierung beteiligt sind sowohl aus Kern- und mitochondrialen Genen abgeleitet. Mitochondrien ihre eigene kreisförmige DNA, kodierend für 13 Proteine ​​sowie tRNAs und mRNAs für die ATP-Produktion ³ notwendig. Jedoch sind viele andere Proteine ​​erforderlich ist, und somit sind nukleär kodierten. Die meisten dieser kerncodierte Proteine ​​an der mitochondrialen Matrix durch Verwendung Präsequenzen am N-Terminus des Vorläuferproteins gezielt und deren Import wird teilweise durch Δψ ^4,5 angetrieben.

Über die zur Erreichung der bioenergetischen einer Zelle, Mitochondrien beeinflussen ebenfalls wichtige Wechselprozessen wie TCA und beta-Oxidation, zelluläre Signalwege, durch Regulieren Calcium, sowie eine zentrale Rolle bei der Apoptose. ⁶ Insbesondere in Zeiten der zellulären Stress, BCL-2-Familie Proteine, die am Wohnsitz oder die Interaktion an der mitochondrialen Außenmembran der Mitochondrien verursachenPermeabilität der äußeren Membran (MOMP) ^7,8. Während MOMP sind Cytochrom c und anderen Proteinen in das Cytosol mit mehreren cytosolischen Proteine ​​freigesetzt, und bilden zusammen einen Komplex genannt apoptosome ^9,10. Die Apoptosom aktiviert Caspasen, die gehen an zelluläre Proteine ​​und DNA während der Ausführungsphase der Apoptose zu spalten. Sobald MOMP auftritt, ΔΨ ist zusammengebrochen und die ATP-Produktion gestoppt. Somit ist, wie die Apoptose ausgelöst wird die Funktion der Mitochondrien beeinträchtigt und Veränderungen in ΔΨ können mitochondriale und Zellgesundheit ¹² korreliert werden. Während die Apoptose ist ein Endpunkt in vielen Krankheitsmodelle, die Funktion der Mitochondrien und Änderungen ΔΨ können auch wertvolle Informationen über die Krankheit Entstehung und / oder Progression ergeben. Zum Beispiel haben die mitochondriale strukturelle und funktionelle Veränderungen im Verlauf von neurodegenerativen Erkrankungen ^13,14 dokumentiert.

Im ersten Teil des Protokolls, isonung intakter Mitochondrien, die ihre ΔΨ behalten beschrieben. HEK-293T-Zellen wurden verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen von rekombinanten TNF-α, IL1-β und IFN-γ ausgesetzt, um die Apoptose zu induzieren. Diese Zytokine wurden ausgewählt, weil sie häufig berichteten hohen in primären humanen septischen Proben ¹⁵ und dem extrinsischen Weg der Apoptose kann durch die Wechselwirkung von TNF-α-Bindung an seinen Rezeptor ⁶ ausgelöst werden. Da es subtile Variationen notwendig funktionelle Mitochondrien aus primären Geweben zu isolieren, verglichen mit kultivierten Zellen und weil viel Forschung verwendet Tieren, beschreibt das Protokoll auch, wie Mitochondrien aus Leber und Rückenmark von anteriore laterale Sklerose (ALS) Mausmodell zu isolieren.

Der zweite Teil des Protokolls wurde entwickelt, um Störungen des mitochondrialen Membranpotenzials überwacht unter Verwendung eines potentialsensitiven Fluoreszenzfarbstoffes mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät. Unterschieds zwischen zellulären Status (dh gesunden vs. ungesunden) durch Quantifizieren der Stärke der ΔΨ von isolierten Mitochondrien in Verbindung mit Trennmitteln, die Atmungsketteninhibitoren, Komplex Inhibitoren und Ionophore, die alle Abfuhr des mitochondrialen Membranpotentials verursachen differenziert. Desto gesünder die Mitochondrien, je größer die Änderung ΔΨ bei Behandlung mit mitochondrialen Inhibitoren, damit die Reaktion von Mitochondrien kann als Indikator für die mitochondriale (Dysfunktionen) Funktion verwendet werden.

Die Verwendung von isolierten Mitochondrien statt in situ Einschätzung Funktion bietet endgültigen Beweise dafür, dass eine Pathologie oder Behandlung Änderungen an der Organelle ^16-18 direkt moduliert. Es gibt zwar Methoden, die in der Literatur zu den Mitochondrien aus kultivierten Zellen zu isolieren, vage sind sie ¹⁷ ab und / oder Spezialausrüstung ^16. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Isolierungsmethode undleicht an andere Zelllinien, einschließlich der Primärgewebe und Kulturen ^13,14,19,20. Viele isolierte Mitochondrien Untersuchungen verwenden die gleichen mitochondrialen Entkuppler und Inhibitoren in diesem Protokoll, jedoch mit einer Clark-Elektrode verwendet wird ⁽²¹ ist ein repräsentatives Beispiel für viele Arbeiten in der Literatur), die wiederum eine sehr spezifische und Spezialmaschine. Darüber hinaus hat diese traditionelle Methode Einschränkungen wie geringe Durchsatz und hohe Komplexität ^22,23 und erfordert eine erhebliche Menge an Mitochondrien (~ 500 ug / Reaktion). In diesem Protokoll wird die Leuchtstoffmembran-Sensing-Potentialsonde TMRE in Verbindung mit einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät, das eine Standardmaschine in vielen Labors ist eingesetzt. TMRE ist weithin angesehen, da es schnell geht Zellen und Mitochondrien isoliert und kann bei niedrigen Konzentrationen ²⁴ verwendet werden. Mehrere Umsetzungen können schnell hintereinander gesetzt werden und Batch analysiert mit diesem Protokoll. Weiterhin wird die Reaktions erfordern eine wesentlich geringe Menge an isolierten Mitochondrien (~ 10 & mgr; g / Reaktion). Um weniger Material erfordern können kleinere Gewebe- oder Zellkulturproben als Ausgangspunkt für Mitochondrien Isolierung verwendet werden, mehrere Wiederholungen oder Reaktionen können möglicherweise genügend Material für die anderen isolierten Mitochondrien Experimente wie die ATP-Produktion, der Sauerstoffverbrauch oder Importieren eingestellt werden, und Assays sind möglich.

Protocol

Alle Tierversuchen entsprach National Institutes of Health Leitlinien und wurden von der Wake Forest University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Brutpaare für SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] Maus-Modell wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. Nicht-transgenen Wildtyp (WT) Frauen und Männer SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] wurden gezüchtet, um SOD1G93A Mäusen und nicht transgenen WT Geschwistern, die in den Experimenten verwendet wurden zu generieren. <p class="jove_t…

Representative Results

Behandlung von HEK-293T-Zellen, die mit 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, und 75 ng / ml IFN-γ (* 3) für 24-48 h führt zu einer fort Mengen von Zelltod (1A ). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit MTT-Assays untersucht und durchgängig zeigt, daß es ~ 10% ige Abnahme in der Lebensfähigkeit der Zellen bei 24 Stunden Behandlung und ~ 20% ige Abnahme bei 48 Stunden Behandlung. Zellen, die mit ähnlichen Konzentrationen (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, und 75 ng / ml IFN-γ) zu ergeben …

Discussion

Behandlung von HEK-293T-Zellen, die mit rekombinanten Cytokinen verursacht moderate Mengen von Zelltod über 48 h (Figur 1). Die Menge an Zelltod, der durch TNF-alpha-Behandlung induziert wird, ist ähnlich wie die zuvor beschriebenen Studien ³⁰ und die Lebensfähigkeit der Zellen sinkt nach gleichzeitiger Verabreichung von mehreren Cytokinen, die größer als summativen Mengen mit jedem Cytokin allein ist auch im Einklang mit der Literatur ^31,32. Die Möglichkeit, die Mengen und A…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
L-glutamic acid	Sigma	G1251	Can use the potassium salt instead.
malic acid	Sigma	M8304	Can use the potassium salt instead.
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma base	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.
sucrose	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water
rotenone	Sigma	R8875	Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin	Sigma	O4876	Highly toxic. Made in ethanol.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.
DMEM	Gibco	11965-084	1x regular (high glucose).
Pen/Strep	Invitrogen	15140-155
L-glutamine	Fisher	SH3002101	Store aliquots at -20C
FBS	Lonza	14-501F	US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Protien Assay Dye (5x)	Bio-Rad	500-0006	Any protein assay can substitute.
BSA	Fisher	BP1600-100	Make 2mg/mL stock in water for protein assay.
MTT powder	Sigma	M2128	Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)	Sigma	NP40S
Recombinant Human IL-1B	Gibco	PCH08014	Once opened store aliquots at -20C
Recombinant Human TNF-alpha	Gibco	PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma	Gibco	PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit	R&D systems	DTC0	Human for HEK-293T cells.