Isolering og funktionel analyse af mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Summary

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Abstract

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Introduction

Levende celler bank metabolisk energi i form af fedt og kulhydrater og anvende denne energi til biosyntese, transport membran og bevægelse. Noget energi opnås i cytosolen ved konvertering af kosten sukker direkte i ATP under glykolyse. Men den vigtigste kilde til ATP-produktion i en celle udnyttes i mitokondrierne via mitokondrie respiratoriske kæde ^1. Arkitekturen af ​​mitokondrier giver den nødvendige rumlige orientering for effektiv og ATP-produktion. Mitokondrier har en dobbelt membran adskilt af et intermembrane rum og sammen med matrixen, den inderste mitokondrie rum, hus komponenterne og koordinere de kemiske reaktioner der er involveret i ATP generation. Den indre membran indeholder en række membranbundne proteinkomplekser, der omfatter den respiratoriske kæde samt ATP syntase, proteinkomplekset, der bringer ADP og Pi sammen for dannelse af ATP. KroenER-membranen er foldet ind cristae og elektroner ledes langs de respiratoriske kæde-komplekser via cytochrom c, et opløseligt elektron bærer, som bevæger sig mellem komplekser i intermembrane rum. Som elektroner bevæger oxidation af reducerende ækvivalenter forekommer og hydrogenioner pumpes fra matrixen til intermembrane rum. Som følge af den høje ionkoncentration i intermembrane rum, en elektrokemisk gradient bygger resulterer i en membran potentiale over den indre mitokondrielle membran (Δψ) ^2. Oxygen er den endelige elektronacceptor af elektron transportkæden og hydrogenioner flyde gennem ATP syntaser fra intermembrane rum tilbage til matrixen, og dermed direkte forårsage ATP formation. Denne fremgangsmåde, som beskrevet i sin helhed er kendt som oxidativ phosphorylering. Folderne i cristae forøge overfladearealet af den indre membran, der giver mulighed for maksimal elektrontransport og ATP-produktion ihvert mitokondrie. De proteiner, enzymer og andre molekyler, der er involveret i den oxidative phosphorylering er afledt fra både nukleare og mitokondrie-gener. Mitokondrier indeholder deres egen cirkulært DNA, der koder for 13 proteiner samt tRNA'er og mRNA'er er nødvendige for ATP-produktion ^3. Men mange flere proteiner kræves, og derfor er det nukleare kodet. De fleste af disse nukleare kodede proteiner er målrettet til det mitokondrielle matrix ved anvendelse af præsekvenser ved N-terminalen af precursorproteinet og deres import drives delvist af Δψ ^4,5.

Ud over at bidrage til bioenergetik af en celle, mitokondrier indflydelse også store metaboliske processer, såsom TCA og beta-oxidation, cellulær signalering gennem regulering calcium, samt en central rolle i apoptose ^6. Specifikt i perioder af cellulær stress, BCL-2-familien proteiner, der er placeret på eller interagere på den mitokondriske ydre membran kan forårsage mitochondrialydre membranpermeabilitet (MOMP) ^7,8. Under MOMP er cytochrom c og andre proteiner frigives i cytosolen, og sammen med flere cytosoliske proteiner danner et kompleks kaldet apoptosome ^9,10. Den apoptosome aktiverer caspaser, der går på at spalte cellulære proteiner og DNA under udførelsesfasen af ​​apoptose. Så snart MOMP sker, er ΔΨ kollapsede og ATP produktion standset. Således som apoptose initieres mitokondriefunktion er kompromitteret og ændringer i ΔΨ kan korreleres til mitokondrie og celle sundhed ^12. Mens apoptose er et endepunkt i mange sygdomsmodeller, mitokondriefunktion og ændringer ΔΨ kan også give værdifuld information om sygdommen access og / eller progression. For eksempel har mitokondriske strukturelle og funktionelle ændringer er dokumenteret i løbet af neurodegenerative sygdomme ^13,14.

I den første del af protokollen, isoning af intakte mitochondrier, der bevarer deres ΔΨ beskrives. HEK-293T-celler blev udsat for forskellige koncentrationer og kombinationer af rekombinant TNF-α, IL1-β og IFN-γ til at inducere apoptose. Disse cytokiner er valgt, fordi de ofte er rapporteret at være høj i primære septisk prøver human ¹⁵ og extrinsicsti apoptose kan udløses ved interaktion af TNF-α-binding til dets receptor ^6. Da der er subtile variationer er nødvendige for at isolere funktionel mitokondrier fra primære væv sammenlignet med dyrkede celler, og fordi megen forskning udnytter dyr, protokollen beskriver også, hvordan at isolere mitokondrier fra leveren og rygmarv af anterior lateral sklerose (ALS) musemodel.

Den anden del af protokollen blev udviklet til at overvåge perturbationer til mitokondriemembranpotentiale anvendelse af en potentiel fluorescensfarvestof med en fluorescerende pladelæser. Forskels mellem cellulær status (dvs. sunde vs. usund) er differentierede ved kvantificering af styrken af ΔΨ af isolerede mitokondrier i forbindelse med frakobling midler, respiratoriske kæde inhibitorer, komplekse inhibitorer og ionoforer, som alle forårsager spredning af det mitokondrielle membranpotentiale. Den sundere mitokondrier, den større ændring i ΔΨ ved behandling med mitochondriale inhibitorer, derfor reaktion mitokondrier kan anvendes som en indikator for mitochondrial (dys) funktion.

Anvendelse af isolerede mitokondrier snarere end in situ vurdering af funktion giver endelige bevis for, at en patologi eller behandling modulerer ændringer organel ^16-18 direkte. Mens der er metoder i litteraturen til at isolere mitokondrier fra dyrkede celler, er de vage ¹⁷ og / eller udnytte specialudstyr ^16. Denne protokol beskriver detaljeret isolation fremgangsmåde og erlet tilpasses til andre cellelinier, herunder primært væv og kulturer ^13,14,19,20. Mange isolerede mitokondrier undersøgelser udnytte de samme mitokondrie uncouplers og inhibitorer, der anvendes i denne protokol, men med en Clark-elektrode ⁽²¹ er et repræsentativt eksempel på mange papirer i litteraturen), som igen er en meget specifik og specialiseret udstyr. Desuden er denne traditionelle metode har begrænsninger, såsom lav produktivitet og høj kompleksitet ^22,23 og kræver en betydelig mængde af mitokondrier (~ 500 pg / reaktion). I denne protokol, er den fluorescerende membran-sensing potentiel sonde TMRE anvendes i forbindelse med en fluorescerende plade læser, som er en standard maskine i mange laboratorier. TMRE er bredt anerkendt, da den træder hurtigt celler og isolerede mitokondrier og kan bruges ved lave koncentrationer ^24. Flere reaktioner kan hurtigt sættes op i tandem og batch analyseres ved hjælp af denne protokol. Endvidere reaktionens kræver en meget lille mængde af isolerede mitokondrier (~ 10 pg / reaktion). Ved at kræve mindre materiale, kan mindre væv eller cellekultur prøver anvendes som et udgangspunkt for mitokondrier isolation, kan flere replikater eller reaktioner oprettes, og potentielt nok materiale til andre isolerede mitokondrier eksperimenter som ATP produktion, iltforbrug, eller import assays er mulige.

Protocol

Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer og blev godkendt af Wake Forest University Animal Care og brug Udvalg. Ynglepar for SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] musemodel blev opnået fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Ikke-transgene vildtype (WT) hunner og SOD1G93A hanner [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] blev avlet til at generere SOD1G93A mus og ikke-transgene WT kuld der blev brugt i forsøgene. 1. Modeller for Investigation <l…

Representative Results

Behandling af HEK-293T-celler med 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, og 75 ng / ml IFN-γ (* 3) for 24-48 timer fører til progressive mængder celledød (figur 1A ). Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af MTT-assays og konsekvent viser, at der er ~ 10% fald i cellelevedygtighed med 24 timers behandling og ~ 20% fald med 48 timers behandling. Celler behandlet med lignende koncentrationer (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, og 75 ng / ml IFN-γ) give lignende celledød resultater på …

Discussion

Behandling af HEK-293T-celler med rekombinante cytokiner forårsager moderate mængder af celledød i løbet af 48 timer (figur 1). Mængden af celledød induceret af TNF-alfa behandling ligner tidligere rapporterede undersøgelser ³⁰ og celleviabilitet falder efter samtidig administration af flere cytokiner, der er større end summative beløb med enhver cytokin alene er også i overensstemmelse med litteraturen ^31,32. Evnen til at tilpasse de beløb og typer af cytokin behandling…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
L-glutamic acid	Sigma	G1251	Can use the potassium salt instead.
malic acid	Sigma	M8304	Can use the potassium salt instead.
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma base	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.
sucrose	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water
rotenone	Sigma	R8875	Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin	Sigma	O4876	Highly toxic. Made in ethanol.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.
DMEM	Gibco	11965-084	1x regular (high glucose).
Pen/Strep	Invitrogen	15140-155
L-glutamine	Fisher	SH3002101	Store aliquots at -20C
FBS	Lonza	14-501F	US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Protien Assay Dye (5x)	Bio-Rad	500-0006	Any protein assay can substitute.
BSA	Fisher	BP1600-100	Make 2mg/mL stock in water for protein assay.
MTT powder	Sigma	M2128	Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)	Sigma	NP40S
Recombinant Human IL-1B	Gibco	PCH08014	Once opened store aliquots at -20C
Recombinant Human TNF-alpha	Gibco	PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma	Gibco	PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit	R&D systems	DTC0	Human for HEK-293T cells.