Visualiseren Non-lytische Exocytosis van<em> Cryptococcus neoformans</em> Van Macrofagen behulp Digital Light Microscopy
Summary
We beschrijven hoe om te visualiseren macrophage- C. neoformans (Cn) interacties in real time, met bijzondere nadruk op het proces van niet-lytische exocytose middels digitale lichtmicroscopie. Met deze techniek individueel geïnfecteerde macrofagen kunnen worden bestudeerd om verschillende aspecten van dit verschijnsel bepalen.
Abstract
Veel aspecten van de infectie van macrofagen door Cryptococcus neoformans zijn uitgebreid onderzocht en goed gedefinieerd. Echter, een specifieke interactie die niet duidelijk wordt begrepen non-lytische exocytose. In dit proces worden gistcellen in de extracellulaire ruimte vrijgemaakt door een slecht begrepen mechanisme dat zowel de macrofaag en Cn levensvatbare bladeren. Hier beschrijven we hoe een groot aantal individueel geïnfecteerde macrofagen volgen een 24 uur infectie periode van tijd verstreken microscopie. Geïnfecteerde macrofagen zijn ondergebracht in een droogstoof met een CO 2 atmosfeer bevestigd aan een microscoop die onder dezelfde voorwaarden als een celcultuur incubator biedt. Levende digitale microscopie kan informatie over de dynamische interacties tussen een gastheer en ziekteverwekker die niet beschikbaar is in statische beelden te leveren. Het kunnen elke geïnfecteerde cel visualiseren kan aanwijzingen geven hoe macrofagen behandelen schimmelinfecties, en vice versa. Deze techniek isa krachtig instrument in de dynamiek die achter een complex fenomeen te bestuderen.
Introduction
De fasen van een schimmelinfectie tussen cryptococcal cellen en macrofagen zijn goed gedocumenteerd 1-3. Na gistcellen worden opgenomen door macrofagen, kan een verscheidenheid aan interacties optreden: de macrofaag kan lyseren vrijgeven zijn fungale lading in de extracellulaire ruimte, of het kan de besmetting te bestrijden door hem de gistcellen binnen de grenzen van de cellulaire membraan 4. Echter, enkele jaren geleden een nieuwe resultaat is beschreven onafhankelijk door twee groepen: niet-lytische exocytose, een werkwijze waarbij een macrofaag uitgewist sommige of alle cryptokokkeninfecties cellen in het omringende milieu of een naburige cel en zowel de gastheer en pathogeen blijven levensvatbaar 5 -8. Verschillende studies hebben geprobeerd om de moleculaire mechanismen achter deze interactie te begrijpen, maar we nog steeds hebben niet een volledige greep op wat drijft dit fenomeen.
De mogelijkheid om beelden in real-time vastleggen en dan vervolgens meerdere infecteren analyserened macrofagen maakt het mogelijk om veel vragen over de fysische eigenschappen omringende niet-lytische exocytose met betrekking tot de timing, de ruimtelijke capaciteit, veranderingen in morfologie en zelfs stress van macrofagen tijdens een schimmelinfectie te beantwoorden. Doordat de cellen worden gehuisvest in een omgeving die vergelijkbaar is met die van een incubator, kunnen we de dynamische aard van macrofaag-schimmel cel interacties blik. Onderzoekers hebben deze techniek gebruikt om diverse onderdelen van dit proces te bestuderen. De rol van de phagosome hierbij is duidelijk gemaakt met fluorescerende kleuring en actine blokkers 9, terwijl een andere groep gebruikt deze methode aan te tonen dat de niet-lytische exocytose werd geblokkeerd in cellen die had WASH kiemvormende eiwitdomeinen geschrapt 10. Het effect van cytokine signalering is ook vastgesteld met behulp van real-time microscopie 11. Deze werkwijze is niet beperkt tot C. neoformans zoals ook werd waargenomen met Candida albicans, another schimmelpathogeen dat de mogelijkheid om macrofagen infecteren 12 heeft. Deze bevindingen zijn voorbeelden van hoe deze methode een schat aan informatie kan verstrekken aan een gebied dat we zo weinig weten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben wij een werkwijze waarmee schimmel-macrofaag interacties kunnen worden opgenomen en in real time geanalyseerd gedurende een periode van 24 uur beschreven. Ons laboratorium heeft dit protocol gebruikt om veel van de temporele aspecten van niet-lytische exocytose bestuderen en blijft real-time microscopie om de morfologische componenten die dit proces omringen bepalen.
Voor deze techniek om ideale resultaten op, moet speciale aandacht worden besteed aan bepaalde stappen in het prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd mede ondersteund door NIH awards 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum ( FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss | ||
References
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
- Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
