חזותי exocytosis ללא ממס של<em> Neoformans קריפטוקוקוס</em> מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית
Summary
אנו מתארים כיצד לחזות ג macrophage- neoformans (CN) אינטראקציות בזמן אמת, עם דגש ספציפי על התהליך של exocytosis לא אלים באמצעות מיקרוסקופ אור דיגיטלית. שימוש בטכניקה זו באופן אינדיבידואלי מקרופאגים נגועים ניתן ללמוד לברר היבטים שונים של תופעה זו.
Abstract
היבטים של הזיהום של מקרופאגים ידי neoformans קריפטוקוקוס רבים נחקרו רבים ומוגדרים היטב. עם זאת, אינטראקציה מסוימת שאינו מובנת באופן ברור הוא exocytosis לא אלים. בתהליך זה, תאי שמרים משתחררים למרחב החוץ תאי על ידי מנגנון הבין היטב שמשאיר את שני מקרופאג וCn קיימא. כאן, אנו מתארים כיצד לעקוב מספר גדול של מקרופאגים נגועים בנפרד לתקופה זיהום 24 שעות על ידי מיקרוסקופ-פקע זמן. מקרופאגים נגועים הם שוכנו בתא חימום עם CO 2 אווירה מחוברת למיקרוסקופ המספק את אותם תנאים כמו חממת טכנולוגיה של תרבית התאים. מיקרוסקופיה דיגיטלית חי יכולה לספק מידע על האינטראקציות הדינמיות בין מארח ופתוגן שאינו זמין מתמונות סטטיות. יכולת לדמיין כל תא נגוע יכול לספק רמזים באשר לאופן מקרופאגים להתמודד זיהומים פטרייתיים, ולהיפך. אני טכניקה זוכלי רב עוצמה sa בלימוד הדינמיקה שנמצאות מאחורי תופעה מורכבת.
Introduction
השלבים של זיהום פטרייתי בין תאים ומקרופאגים cryptococcal מתועדים היטב 1-3. לאחר תאי שמרים הם מעובדים על ידי מקרופאגים, מגוון רחב של אינטראקציות עלול להתרחש: מקרופאג עשוי lyse שחרור העומס פטרייתי שלה לתוך מרחב החוץ תאי, או שזה יכול לשלוט בזיהום על ידי שמירה על תאי שמרים בתוך גבולות קרום התא שלו 4. עם זאת, לפני כמה שנות תוצאה חדשה שתוארה באופן עצמאי על ידי שתי קבוצות: exocytosis לא אלים, תהליך שבו מקרופאג נמחק כל תאי cryptococcal או לסביבה או תא השכן והן המארח והפתוגן להישאר קיימא 5 -8. מספר מחקרים ניסו להבין את המנגנונים המולקולריים מאחורי אינטראקציה זו, אך עדיין אין לנו הבנה מלאה על מה שמניע את התופעה הזאת.
היכולת ללכוד תמונות בזמן אמת ולאחר מכן לאחר מכן לנתח להדביק מרובהעורך מקרופאגים מאפשר לענות על שאלות רבות על התכונות הפיזיות המקיפות exocytosis לא אלים בכל הקשור לעיתוי, יכולת מרחבית, שינוי במורפולוגיה ואפילו לחץ של מקרופאגים בזיהום פטרייתי. ידי מתן אפשרות לתאים להיות שוכנו בסביבה שדומה לזו של חממה, אנו יכולים להציץ באופי הדינמי של אינטראקציות תא מקרופאג פטרייתי. חוקרים השתמשו בטכניקה זו כדי ללמוד מרכיבים שונים של תהליך זה. התפקיד של phagosome בתהליך זה נעשה לכאורה באמצעות מכתים הניאון ויקטינו סוכני חסימה 9, בעוד שקבוצה אחרת השתמשה בשיטה זו כדי להראות שexocytosis לא אלים נחסם בתאים שהיו WASH nucleating תחומים חלבון נמחק 10. ההשפעה של איתות ציטוקינים גם הובררה באמצעות מיקרוסקופ בזמן אמת 11. תהליך זה אינו מוגבל לג neoformans כפי שגם נצפה עם קנדידה אלביקנס, another פתוגן פטרייתי שיש לו את היכולת להדביק מקרופאגים 12. ממצאים אלה הם דוגמאות לאופן ששיטה זו יכולה לספק שפע של מידע לאזור שאנחנו יודעים כל כך מעט על.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן יש לנו תארנו שיטה שבאמצעותה ניתן להקליט אינטראקציות פטרייתי-macrophage ומנותח בזמן אמת על פני תקופה 24 שעות. המעבדה שלנו השתמשה בפרוטוקול זה כדי ללמוד רב של ההיבטים זמניים של exocytosis לא אלים ותמשיך להשתמש במיקרוסקופ בזמן אמת כדי לברר את הרכיבים מורפולוגיים המקיפים את הת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן בחלקו על ידי הפרסים NIH 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum ( FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss | ||
References
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
- Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
