गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस Visualizing<em> क्रिप्टोकोकस neoformans</em> डिजिटल लाइट माइक्रोस्कोपी का उपयोग मैक्रोफेज से
Summary
हम macrophage- सी कल्पना करने के लिए कैसे का वर्णन neoformans (CN) डिजिटल प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस की प्रक्रिया पर विशेष जोर देने के साथ वास्तविक समय में बातचीत,. व्यक्तिगत रूप से संक्रमित मैक्रोफेज इस तकनीक का उपयोग इस घटना के विभिन्न पहलुओं का पता लगाने के लिए अध्ययन किया जा सकता है.
Abstract
क्रिप्टोकोकस neoformans से मैक्रोफेज के संक्रमण के कई पहलुओं को बड़े पैमाने पर अध्ययन किया और अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है. हालांकि, स्पष्ट रूप से समझ नहीं है कि एक विशेष बातचीत गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस है. इस प्रक्रिया में, खमीर कोशिकाओं मैक्रोफेज और CN व्यवहार्य दोनों को छोड़ देता है कि एक खराब समझ तंत्र द्वारा बाह्य अंतरिक्ष में जारी किए हैं. यहाँ, हम समय व्यपगत माइक्रोस्कोपी द्वारा एक 24 घंटा संक्रमण अवधि के लिए व्यक्तिगत रूप से संक्रमित मैक्रोफेज की एक बड़ी संख्या का पालन करने के लिए क्या करते हैं. संक्रमित मैक्रोफेज एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर के रूप में ही स्थितियां प्रदान करता है कि एक खुर्दबीन से जुड़ी एक सीओ 2 माहौल के साथ एक हीटिंग कक्ष में रखे जाते हैं. लाइव डिजिटल माइक्रोस्कोपी स्थिर छवियों से उपलब्ध नहीं है कि एक मेजबान और रोगज़नक़ के बीच गतिशील बातचीत के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. ठीक इसके विपरीत मैक्रोफेज फंगल संक्रमण कैसे संभाल के रूप में सुराग प्रदान कर सकते हैं और प्रत्येक संक्रमित कोशिका कल्पना करने में सक्षम होने के नाते. इस तकनीक को मैंएक जटिल घटना के पीछे हैं कि गतिशीलता के अध्ययन में एसए शक्तिशाली उपकरण.
Introduction
क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं और मैक्रोफेज के बीच एक कवक संक्रमण के चरणों में अच्छी तरह से 1-3 दर्ज हैं. खमीर कोशिकाओं मैक्रोफेज द्वारा किया जाता है, के बाद बातचीत की एक किस्म हो सकती है: बृहतभक्षककोशिका बाह्य अंतरिक्ष में अपने फंगल लोड रिहा lyse सकता है, या यह अपने सेलुलर झिल्ली 4 के अंदर खमीर कोशिकाओं रखने के द्वारा संक्रमण को नियंत्रित कर सकता है. गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस, एक बृहतभक्षककोशिका आसपास के वातावरण में क्रिप्टोकोकल कोशिकाओं में से कुछ या सभी expunged जिसमें एक प्रक्रिया या एक पड़ोसी सेल और मेजबान और रोगज़नक़ दोनों 5 व्यवहार्य रहना: हालांकि, कई साल पहले एक नई परिणाम दो समूहों द्वारा स्वतंत्र रूप से वर्णित किया गया -8. कई अध्ययनों से इस बातचीत के पीछे आणविक तंत्र को समझने की कोशिश की है, लेकिन हम अभी भी इस घटना ड्राइव पर एक पूर्ण समझ नहीं है.
क्षमता वास्तविक समय में छवियों पर कब्जा करने और फिर बाद में कई संक्रमित का विश्लेषण करने के लिएएड मैक्रोफेज एक एक कवक संक्रमण के दौरान आकृति विज्ञान और मैक्रोफेज की भी तनाव में समय, स्थानिक क्षमता, परिवर्तन के संबंध में गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस आसपास के भौतिक गुणों के बारे में कई सवालों के जवाब देने की अनुमति देता है. कोशिकाओं एक मशीन के बराबर है कि एक वातावरण में रखे होने की अनुमति देकर, हम बृहतभक्षककोशिका कवक सेल बातचीत की गतिशील प्रकृति झलक सकता है. शोधकर्ताओं ने इस प्रक्रिया के विभिन्न घटकों का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. एक अन्य समूह गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस प्रोटीन डोमेन nucleating धो 10 नष्ट कर दिया था है कि कोशिकाओं में अवरुद्ध था कि दिखाने के लिए इस विधि का इस्तेमाल करते हुए इस प्रक्रिया में फेगोसोम की भूमिका, फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना और actin अवरुद्ध एजेंट 9 का उपयोग कर स्पष्ट कर दिया गया था. साइटोकाइन संकेत का असर भी वास्तविक समय माइक्रोस्कोपी 11 का उपयोग कर पता लगाया गया है. इस प्रक्रिया को सी तक सीमित नहीं है यह रूप neoformans भी कैंडिडा सफेद के साथ देखा गया है, anotheमैक्रोफेज 12 को संक्रमित करने की क्षमता है कि कवक रोगज़नक़ आर. इन निष्कर्षों को इस विधि के बारे में हम बहुत कम जानते एक क्षेत्र के लिए जानकारी का खजाना प्रदान कर सकते हैं कि कैसे के उदाहरण हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम फंगल-बृहतभक्षककोशिका बातचीत दर्ज की गई और एक 24 घंटे की अवधि में वास्तविक समय में विश्लेषण किया जा सकता है जिसके द्वारा एक विधि का वर्णन किया है. हमारी प्रयोगशाला गैर अपघट्य एक्सोसाइटोसिस के लौ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध एनआईएच पुरस्कार 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum ( FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss | ||
References
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