Visualisera Icke lytisk Exocytos av<em> Cryptococcus neoformans</em> Från Makrofager Använda Digital Light mikroskopi

Summary

Vi beskriver hur du visualisera macrophage- C. neoformans (Cn) interaktioner i realtid, med särskild tonvikt på processen för icke-lytisk exocytos med digital ljusmikroskop. Genom att använda denna teknik för sig infekterade makrofager kan studeras för att utröna olika aspekter av detta fenomen.

Abstract

Många aspekter av infektion av makrofager från Cryptococcus neoformans har studerats omfattande och väldefinierade. Men en viss interaktion som inte är klart icke-lytisk exocytos. I denna process är jästceller släpps ut i det extracellulära utrymmet genom en dåligt förstådd mekanism som lämnar både makrofag och Cn livskraftig. Här beskriver vi hur man följer ett stort antal individuellt infekterade makrofager för en 24 tim infektionsperioden med tids förföll mikroskopi. Infekterade makrofager är inrymda i en värmekammare med en CO ₂ atmosfär fäst vid ett mikroskop som ger samma förhållanden som en cell-odlingsinkubator. Live digital mikroskopi kan ge information om det dynamiska samspelet mellan en värd och patogen som inte är tillgänglig från statiska bilder. Att kunna visualisera varje infekterad cell kan ge ledtrådar till hur makrofager hanterar svampinfektioner, och vice versa. Denna teknik isa kraftfullt verktyg för att studera den dynamik som ligger bakom ett komplext fenomen.

Introduction

Stegen i en svampinfektion mellan kryptokock celler och makrofager är väldokumenterade ^1-3. Efter jästceller intas av makrofager, kan en mängd olika interaktioner inträffa: makrofagen kan lysera släpper sin svamp belastning i det extracellulära utrymmet, eller det kan kontrollera infektionen genom att hålla jästcellerna inom gränserna för dess cellulära membran ^4. Men flera år sedan ett nytt utfall beskrevs självständigt av två grupper: icke-lytisk exocytos, en process i vilken en makrofag strukits några eller alla av de kryptokockcellerna in i den omgivande miljön eller en angränsande cell och både värd och patogen förbli livskraftig ^{5 -8.} Flera studier har försökt att förstå de molekylära mekanismerna bakom denna interaktion, men vi har fortfarande inte ett fullt grepp om vad som driver detta fenomen.

Förmågan att ta bilder i realtid och därefter analysera flera infekteraed makrofager gör att man kan svara på många frågor om de fysiska egenskaperna kring icke-lytisk exocytos när det gäller timing, spatial förmåga, förändring i morfologi och även stress av makrofager under en svampinfektion. Genom att låta de celler som skall inrymmas i en miljö som är jämförbar med den i en inkubator, kan vi skymta den dynamiska karaktären hos makrofag-svampcellinteraktioner. Forskare har använt denna teknik för att studera olika komponenterna i denna process. Roll phagosome i denna process gjordes synliga med hjälp av fluorescerande färgning och aktin blockerande medel ^9, medan en annan grupp använde denna metod för att visa att icke-lytisk exocytos blockerades i celler som har haft WASH kärnproteindomäner utgår ^10. Effekten av cytokin signalering har också påvisas med hjälp realtid mikroskopi ^11. Denna process är inte begränsad till C. neoformans som det har också observerats med Candida albicans, another svamppatogen som har förmågan att infektera makrofager ^12. Dessa fynd är exempel på hur denna metod kan ge en mängd information till ett område som vi vet så lite om.

Protocol

Alla djur arbete gjordes i enlighet med regler och riktlinjer för Institutet för djurstudier vid Albert Einstein College of Medicine. 1. Tillväxtvillkor C. neoformans H99 (serotyp A) Väx individuell C. neoformans (Cn) kolonier på Sabouraud agarplattor. En dag före experimentet, välja en koloni och inokulera 10 ml Sabouraud buljong. Låt kulturen växa över natten vid 37 ° C under skakning vid en hastighet av 250 rpm. <p clas…

Representative Results

De bilder som denna teknik producerar kan analyseras på en mängd olika sätt att samla information kring vad som händer efter celler har fagocyteras C. neoformans. Som framgår av Figur 1, finns det cirka 100 makrofager som antingen infekterade eller oinfekterade. Var och en av dessa makrofager ger betraktaren en möjlighet att studera värd-patogen interaktioner på en mycket mikroskopisk nivå. Som Figurerna 2 och 3 visar, finns det olika utfall som kan up…

Discussion

Här har vi beskrivit en metod med vilken svamp-makrofag interaktioner kan spelas in och analyseras i realtid under en 24 timmarsperiod. Vårt laboratorium har använt detta protokoll för att studera många av de tidsmässiga aspekter av icke-lytisk exocytos och kommer att fortsätta att använda realtids mikroskopi att fastställa de morfologiska komponenter som omger denna process.

För denna teknik för att ge perfekt resultat, bör särskild uppmärksamhet ägnas åt vissa steg i protok…

Materials

Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal Calf Serum ( FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Non-essential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Toxic
3003 Tissue Culture Petri Dishes	Fisher Scientific	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Mouse IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Non-commerical antibody produced in our lab
Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber	Zeiss