Identifier les sites d'interaction protéine-protéine à l'aide de peptides tableaux
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
Les interactions protéine-protéine médient la plupart des processus dans la cellule et le contrôle de l'homéostasie de l'organisme vivant. Les interactions entre protéines peut provoquer une baisse de la maladie, ce qui rend les interactions entre protéines cibles médicamenteuses importantes. Il est donc très important de comprendre ces interactions au niveau moléculaire. Les interactions protéiques sont étudiés en utilisant une variété de techniques allant de dosages biochimiques et cellulaires à des analyses quantitatives biophysiques, et ceux-ci peuvent être réalisés soit avec des protéines de pleine longueur, avec des domaines de protéines ou de peptides. Les peptides sont d'excellents outils pour étudier les interactions entre protéines depuis peptides peuvent être synthétisés facilement et permettre la mise au point sur des sites d'interaction spécifiques. Tableaux peptidiques permettent l'identification des sites d'interaction entre les deux protéines, ainsi que le dépistage de peptides qui se lient à la protéine cible à des fins thérapeutiques. Ils permettent également des études SAR haut débit. Pour l'identification des sites de liaison, un Typical réseau de peptides contient habituellement se chevauchant partiellement 10-20 résidus des peptides dérivés des séquences complètes d'un ou plusieurs protéines partenaires de la protéine cible souhaitée. La sélection de la gamme pour la liaison de la protéine cible révèle les peptides de liaison, correspondant aux sites de liaison dans les protéines partenaires, dans une méthode facile et rapide à l'aide de seulement petite quantité de protéines.
Dans cet article, on décrit un protocole de criblage de matrices de peptides pour la cartographie des sites d'interaction entre une protéine cible et de ses partenaires. Le réseau peptidique est conçue sur la base des séquences des protéines partenaires compte tenu de leurs structures secondaires. Les tableaux utilisés dans ce protocole étaient Celluspots tableaux préparés par Intavis Instruments de bioanalyse. L'ensemble est bloqué pour éviter une liaison non spécifique et ensuite incubé avec la protéine étudiée. La détection en utilisant un anticorps révèle des peptides de liaison correspondant à des sites d'interactions spécifiques entre les protéines.
Introduction
Les interactions protéine-protéine médient la plupart des processus dans la cellule vivante. Les interactions entre protéines peut provoquer une baisse de la maladie, ce qui rend les interactions entre protéines cibles médicamenteuses importantes. Il est donc très important de comprendre ces interactions au niveau moléculaire. Les interactions protéiques sont étudiés en utilisant une variété de techniques allant de dosages biochimiques et cellulaires à des analyses quantitatives biophysiques, et ceux-ci peuvent être réalisés soit avec des protéines de pleine longueur, avec des domaines de protéines ou de peptides. Les peptides sont d'excellents outils pour étudier les interactions entre protéines. En effet, les peptides peuvent être facilement synthétisés et permettent la mise au point d'un site d'interaction spécifique d'une part, et sur plusieurs cibles protéiques d'une manière à haut débit, d'autre part de 1,2. dépistage de réseau de peptides est un moyen rapide, facile à réaliser procédé pour obtenir une grande quantité de données sur les interactions d'une protéine cible avec de nombreux partenaires dans un court laps de temps 3. Contrairement à d'autres méthodes biochimiques ou biophysiques pour détecter et analyser les interactions protéine-protéine, le criblage de la matrice de peptide nécessite une très faible concentration de protéine et peut détecter de très faible liaison. matrices de peptides peuvent être utilisés pour de nombreuses applications dans les interactions peptide-protéine tels que la cartographie de la protéine-protéine ou des sites d'interaction ligand-récepteur 4, les interfaces d'homo- ou d'hétéro-oligomérisation, des anticorps caractérisant épitopes 5, étudier les activités enzymatiques 6 et un débit élevé structure- relation de l'activité (SAR) étudie 7. Pour un examen approfondi sur le dépistage du réseau de peptides voir Katz et al. 4
Plusieurs types de tableaux peptidiques existent actuellement. Il existe deux stratégies de synthèse pour la fabrication de grands ensembles de peptides: synthèse des peptides avant de les attacher au support solide, ou la synthèse de peptides directement sur le support solide, en utilisant essentiellement la technique de 4,8 SPOT. Leles peptides sont synthétisés sur le support solide généralement par 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc) 8 chimie. Parmi les schémas de synthèse courantes sont l'attachement peptide par l'extrémité N-terminale (par exemple, les JPT PepStar tableaux 9) et la fixation de peptides grâce à l'extrémité C-terminale (par exemple, des tableaux de PEPSCAN pepchip 10, JPT pepspot tableaux 9 et Intavis tableaux de celluspot 11) 4. Le support solide peut varier et il en va de la chimie du couplage peptidique pour elle. Peptides Cys-terminés peuvent être fixés à des lames de verre par l'intermédiaire du groupe thiol 12. L'extrémité N-terminale d'un peptide peut être lié de manière covalente à un groupe hydroxyle sur la membrane de cellulose par estérification de l'acide aminé fixé huit.
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour cribler des matrices de peptides en tant que méthode pour l'étude des interactions protéine-protéine. Le tableau que nous avons utilisé est le tableau Celluspots, qui est un micro-array contenant grand amount de taches (doublons de 384 points) sur une petite membrane de cellulose pris en charge par une lame de verre. Cela permet de travailler avec de faibles volumes de protéines et d'anticorps et d'obtenir quantité importante de données par expérience unique. Ce tableau contient également la densité de peptide élevé qui permet la détection de faible affinité de liaison. La matrice a été utilisé pour cartographier l'interaction STIL-CHFR, ce qui est très important pour le contrôle de la prolifération cellulaire 13 normal. Interaction non contrôlée entre les deux protéines peut conduire au développement d'un cancer. En cartographiant cette interaction, nous avons trouvé le site de liaison spécifique et les résidus 14 de liaison. Cela ouvre la voie à la conception d'inhibiteurs rationnels qui inhibent cette interaction protéine-protéine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dépistage du tableau peptide est un excellent outil pour identifier les sites de liaison d'une protéine cible dans ses partenaires. Ce test est rapide et facile à réaliser et les résultats peuvent être obtenus dans un ou deux jours ouvrables. Dépistage du tableau peptide est polyvalent et peut être utilisé à de nombreuses fins. Il peut être utilisé pour caractériser les modifications de traduction soumettre comme la phosphorylation et l'identification des substrats de kinases. Par exemple, la kinase…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AF a été financé par une subvention à partir du Conseil européen de la recherche sous septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7 / 2007-2013) / accord de subvention du CER n ° 203413 et par le Centre Minerva pour Bio-hybride systems.HA complexe et AI sont pris en charge par Dalia et Dan Maydan bourse pour les étudiants de diplôme d'études supérieures à l'Université hébraïque de Jérusalem.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
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