Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln die meisten Prozesse in lebenden Zellen und die Kontrolle der Homöostase des Organismus. Impaired Protein-Interaktionen können in Krankheit führen, was Protein-Interaktionen wichtige Angriffspunkte für Arzneimittel. Es ist daher sehr wichtig, diese Interaktionen auf molekularer Ebene zu verstehen. Protein-Wechselwirkungen sind mit einer Vielzahl von Techniken, von der zellulären und biochemischen Tests, quantitative biophysikalische Assays untersucht, und diese können mit vollständigen Proteine durchgeführt werden, entweder mit Proteindomänen oder mit Peptiden. Peptide dienen als ausgezeichnete Werkzeuge, um Protein-Wechselwirkungen zu studieren, da Peptide können leicht synthetisiert werden und ermöglichen die Konzentration auf bestimmte Interaktionsstellen. Peptidarrays ermöglichen die Identifizierung der Interaktionsstellen zwischen zwei Proteinen sowie Screening nach Peptiden, die das Zielprotein für therapeutische Zwecke binden. Sie erlauben auch einen hohen Durchsatz SAR-Studien. Zur Identifizierung der Bindungsstellen, eine typical Peptidanordnung enthält in der Regel teilweise überlappenden Peptiden 10-20 Resten der vollen Sequenzen von einem oder mehreren Partnerproteine der gewünschten Zielprotein. Screenen des Arrays zur Bindung des Zielproteins zeigt die Bindungspeptide, die den Bindungsstellen in den Partnerproteine, in einer einfachen und schnellen Verfahren mit nur geringen Menge an Protein.
In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für das Screening von Peptidarrays für die Abbildung der Interaktionsstellen zwischen einem Zielprotein und seine Partner. Die Peptidanordnung ist auf der Basis der Sequenzen der Partnerproteine unter Berücksichtigung ihrer Sekundärstruktur ausgebildet. Die in diesem Protokoll verwendeten Arrays waren Celluspots Arrays INTAVIS Bioanalytische Instrumente vorbereitet. Das Array wird blockiert, um unspezifische Bindung zu verhindern und anschließend mit dem untersuchten Protein inkubiert. Nachweis unter Verwendung eines Antikörpers offenbart die Bindungspeptide, die den spezifischen Wechselwirkungsstellen zwischen den Proteinen.
Introduction
Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln die meisten Prozesse in der lebenden Zelle. Impaired Protein-Interaktionen können in Krankheit führen, was Protein-Interaktionen wichtige Angriffspunkte für Arzneimittel. Es ist daher sehr wichtig, diese Interaktionen auf molekularer Ebene zu verstehen. Protein-Wechselwirkungen sind mit einer Vielzahl von Techniken, von der zellulären und biochemischen Tests, quantitative biophysikalische Assays untersucht, und diese können mit vollständigen Proteine durchgeführt werden, entweder mit Proteindomänen oder mit Peptiden. Peptide dienen als ausgezeichnete Werkzeuge, um Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Dies ist, weil Peptide können leicht synthetisiert werden und ermöglichen die Fokussierung auf einen bestimmten Interaktionsstelle einerseits und auf mehreren Protein-Targets in einem Hochdurch Weise auf der anderen Seite 1,2. Peptidarray Screening ist eine schnelle, einfache Verfahren zur Gewinnung einer großen Menge von Daten über die Wechselwirkungen eines Zielproteins mit zahlreichen Partnern in einer kurzen Zeit durchzuführen 3. Im Gegensatz zu anderen biochemischen oder biophysikalischen Methoden zur Detektion und Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen, Peptid-Array-Screening erfordert eine sehr geringe Konzentration an Protein und sehr schwache Bindung zu detektieren. Peptid-Arrays können für viele Anwendungen in der Peptid-Protein-Wechselwirkungen, wie Mapping von Protein-Protein oder Rezeptor-Ligand-Interaktionsstellen 4, Homo- oder Hetero-Oligomerisierung Schnittstellen verwendet werden, kennzeichn Antikörper Epitope 5, studiert Enzymaktivitäten 6 und hohen Durchsatz struktur Aktivitäts-Beziehung (SAR) studiert 7. Für eine eingehende Bewertung Peptidarray Screening siehe Katz et al. 4
Verschiedene Arten von Peptidarrays existieren derzeit. Es gibt zwei Hauptstrategien für die Herstellung von synthetischen Peptidarrays: Synthese der Peptide vor der Befestigung an dem festen Träger oder der Synthese von Peptiden direkt an den festen Träger, vor allem mit Hilfe der SPOT-Technik 4,8. DiePeptide auf dem festen Träger in der Regel von 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Chemie 8 synthetisiert. Unter den gemeinsamen Syntheseschemata sind Peptid Befestigung durch den N-Terminus (zB JPT Pepstar Arrays 9) und Peptid-Anlage durch den C-Terminus (zB PEPSCAN pepchip Arrays 10, JPT pepspot Arrays 9 und INTAVIS celluspot Arrays 11) 4. Der feste Träger kann variieren und damit auch die Chemie der Peptidkupplung zu. Cys-terminierten Peptide können über die Thiolgruppe 12 auf Glasobjektträgern befestigt werden. Der N-Terminus eines Peptids kovalent an eine Hydroxylgruppe an der Cellulose-Membran, durch Veresterung der Aminosäure gebunden befestigt 8.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für das Screening von Peptid-Arrays als ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Das Array verwendeten wir die Celluspots Array, das ein Mikroarray mit großen amo istunt von Flecken (Duplikate bis 384 Spots) auf einer kleinen Cellulosemembran durch einen Glasträger unterstützt. Dies ermöglicht das Arbeiten mit geringen Mengen an Protein und Antikörper und erhalten erhebliche Menge an Daten pro einzigen Experiment. Dieses Array enthält auch eine hohe Dichte, die Peptid-Detektion mit geringer Affinität bindenden ermöglicht. Das Array wurde zur Kartierung des STIL-CHFR Interaktion, die sehr wichtig für die normale Zellproliferation 13 Steuerung verwendet wird. Unkontrollierte Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen zur Entwicklung von Krebs. Durch die Abbildung dieser Wechselwirkung fanden wir die spezifische Bindungsstelle und Bindungsreste 14. Dies ebnet den Weg für die Entwicklung rationeller Inhibitoren, die diese Protein-Protein-Wechselwirkung hemmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Peptidarray-Screening ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Identifizierung der Bindungsstellen eines Zielproteins in seine Partner. Dieser Test ist schnell und einfach durchzuführen und die Ergebnisse können in einem oder zwei Tagen erhalten werden. Peptidarray Screening ist vielseitig und kann für viele Zwecke verwendet werden. Es kann für die Charakterisierung von Übersetzungs- Modifikationen wie Phosphorylierung und Identifizieren Substrate von Kinasen eingesetzt werden. Zum Beispiel: der FLT3-Kinase, die v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AF wurde durch einen Starting Grant des Europäischen Forschungsrates des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft unterstützt (FP7 / 2007-2013) / ERC Finanzhilfevereinbarung Nr 203.413 und von der Minerva-Zentrum für Bio-Hybridkomplex systems.HA und AI werden unterstützt durch das Dalia und Dan Maydan Fellowship für fortgeschrittene Studierende an der Hebräischen Universität von Jerusalem.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
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