RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.
As células estaminais hematopoiéticas (HSCs) são utilizados clinicamente para o tratamento de transplante para reconstruir o sistema hematopoiético de um paciente em muitas doenças, tais como leucemia e linfoma. Elucidação dos mecanismos que controlam HSCs auto-renovação e diferenciação é importante para a aplicação de HSCs para a pesquisa e usos clínicos. No entanto, não é possível obter grande quantidade de HSCs, devido à sua incapacidade para proliferar in vitro. Para superar este obstáculo, foi utilizada uma linha de células derivadas da medula óssea do rato, a linhagem de células EML (eritróide, mielóide e linfóide), como um sistema modelo para este estudo.
RNA-seqüenciamento (RNA-Seq) tem sido cada vez mais usado para substituir microarray para estudos de expressão gênica. Nós relatamos aqui um método detalhado do uso da tecnologia de RNA-Seq para investigar os possíveis fatores-chave na regulação da célula EML auto-renovação e diferenciação. O protocolo fornecido neste artigo está dividido em três partes. O primeiro part explica como a cultura de células de EML e separado Lin-CD34 + e células Lin-CD34 @. A segunda parte do protocolo oferece procedimentos detalhados para a preparação total de RNA ea construção da biblioteca para posterior de alto rendimento de sequenciamento. A última parte descreve o método para análise de dados de RNA-Seq e explica como usar os dados para identificar fatores de transcrição diferencialmente expressos entre Lin-CD34 + e células Lin-CD34 @. Os fatores de transcrição mais significativamente diferencialmente expressos foram identificados como sendo os possíveis reguladores chave que controlam as células EML auto-renovação e diferenciação. Na discussão deste trabalho, destacamos as principais etapas para um desempenho de sucesso desta experiência.
Em resumo, este trabalho oferece um método de usar a tecnologia de RNA-Seq para identificar potenciais reguladores de auto-renovação e diferenciação em células EML. Os principais fatores identificados são submetidos à análise funcional jusante in vitro e in vivo.
As células estaminais hematopoiéticas são células sanguíneas raras que residem principalmente no nicho da medula óssea de adultos. Eles são responsáveis pela produção de células necessárias para a reconstituição do sangue e os sistemas imunitários 1. Como um tipo de células estaminais, HSCs são capazes de tanto a auto-renovação e diferenciação. Elucidar os mecanismos que controlam a decisão destino de HSCs, direção ou auto-renovação ou diferenciação, vai oferecer orientações valiosas sobre a manipulação de HSCs para pesquisas de doenças de sangue e uso clínico 2. Um problema enfrentado pelos pesquisadores é que HSCs podem ser mantidas e expandidas in vitro de forma muito limitada; a grande maioria dos seus descendentes são parcialmente diferenciadas em cultura 2.
A fim de identificar os principais reguladores que controlam os processos de auto-renovação e diferenciação em uma escala de todo o genoma, foi utilizada uma linha primitiva de células progenitoras hematopoiéticas do rato EML como um sistema modelo. Thé A linha celular foi derivada a partir de 3,4 medula óssea de murino. Quando alimentados com diferentes factores de crescimento, as células podem diferenciar-se em EML eritróide, mielóide, e células linfóides in vitro, 5. É importante notar que esta linhagem celular pode ser propagada em grande quantidade no meio de cultura contendo factor de células estaminais (SCF) e ainda reter a sua multipotencialidade. Células EML podem ser separados em subpopulações de auto-renovação Lin-SCA + CD34 + e parcialmente diferenciadas células Lin-SCA-CD34 @ com base em marcadores de superfície CD34 e SCA 6. Semelhante a curto prazo HSCs, SCA + CD34 + células são capazes de auto-renovação. Quando tratados com células CD34 + SCF, Lin-SCA + pode regenerar rapidamente uma população mista de células CD34 + e Lin-SCA-CD34 @ Lin-SCA + e continuam a proliferar 6. As duas populações são semelhantes na morfologia e têm níveis semelhantes de ARNm de c-kit e proteína 6. Células Lin-SCA-CD34 @ são capazes de propagar em meios contendo IL-3 em vez de SCF 3. Unveiling principais reguladores da EML decisão destino celular vai oferecer melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares em transição inicial de desenvolvimento durante a hematopoiese.
A fim de investigar as diferenças moleculares subjacentes entre a auto-renovação de células Lin-SCA-CD34 @ parcialmente diferenciados Lin-SCA + CD34 + e, usamos RNA-Seq para identificar genes diferencialmente expressos. Em particular, vamos nos concentrar em fatores de transcrição, como fatores de transcrição são cruciais na determinação do destino da célula. RNA-Seq é uma abordagem desenvolvida recentemente, que utiliza as capacidades de sequenciamento de próxima geração (NGS) tecnologias para o perfil e quantificar RNAs transcritos do genoma 7,8. Em resumo, o ARN total é poli-A e fragmentada seleccionado como o modelo template.The ARN inicial é então convertido em cDNA usando transcriptase reversa. De modo a mapear full-length transcritos de ARN, utilizando, ARN não degradado intacta para a construção da biblioteca de cDNA é importante. Para o purrepresentar de sequenciamento, as sequências adaptadoras específicos são adicionados a ambas as extremidades do cDNA. Em seguida, na maioria dos casos, as moléculas de ADNc são amplificados por PCR e sequenciado de uma forma de alto rendimento.
Após o seqüenciamento, a resultante leituras podem ser alinhados com um genoma de referência e um banco de dados de transcriptoma. O número de leituras que mapeiam para o gene de referência é contada e essa informação pode ser usada para estimar o nível de expressão do gene. A lê também podem ser montados, de novo sem um genoma de referência, permitindo que o estudo de transcriptomes em organismos modelo não-9. Tecnologia de RNA-seq também tem sido usado para detectar as isoformas de splicing, 10-12 novos transcritos 13 e 14 fusões de genes. Em adição à detecção de genes codificadores de proteínas, o RNA-Seq também pode ser usada para detectar e analisar romance nível de transcrição de RNAs não-codificantes, tais como longa não codificante de ARN 15,16, microARN 17, 18, etc siRNA. Por causa de tele precisão deste método, tem sido utilizado para a detecção de variações de nucleótidos simples 19,20.
Antes do advento da tecnologia de RNA-Seq, microarray foi o principal método utilizado para analisar o perfil de expressão do gene. Pré-concebidas sondas são sintetizados e subsequentemente ligado a uma superfície sólida para formar uma lâmina de microarray 21. ARNm é extraído e convertido em cDNA. Durante o processo de transcrição reversa, os nucleótidos marcados com fluorescência são incorporados no cDNA e o cDNA pode ser hibridado nas lâminas de microarray. A intensidade do sinal recolhido a partir de um ponto específico depende da quantidade de ADNc de ligação com a sonda específica naquele ponto 21. Em comparação com a tecnologia de RNA-Seq, microarray tem várias limitações. Primeiro, microarray confia no conhecimento pré-existente de anotação de genes, enquanto a tecnologia de RNA-Seq é capaz de detectar novas transcrições em alto nível de fundo relativa, o que limita a sua utilização quando a GEnível de expressão ne é baixo. Além disso, a tecnologia de RNA-Seq tem muito maior alcance dinâmico de detecção (8.000 vezes) 7, que, devido ao fundo e saturação dos sinais, a precisão de microarray é limitado para ambos os genes altamente expressos e humilde 7,22. Finalmente, as sondas de microarranjo diferem em suas eficiências de hibridização, que tornam os resultados menos confiáveis quando se comparam os níveis de expressão relativos de diferentes transcritos dentro de uma amostra de 23. Embora RNA-Seq tem muitas vantagens sobre microarranjo, a análise de dados é complexo. Esta é uma das razões que muitos pesquisadores ainda usam microarray em vez de RNA-Seq. Várias ferramentas de bioinformática são necessários para o processamento de dados de RNA-Seq e análise 24.
Entre vários sequenciamento de próxima geração (NGS) plataformas, 454, Illumina, SOLID e Ion Torrent são os mais utilizados. 454 foi a primeira plataforma de NGS comercial. Em contraste com as outras plataformas de sequenciaçãocomprimento como illumina e sólida, a plataforma 454 gera mais ler (em média 700 base de leituras) 25. Lê mais são melhores para a caracterização inicial de transcriptiome devido à sua maior eficiência montar 25. A principal desvantagem da plataforma 454 é o seu custo elevado por megabases de sequência. A Illumina e plataformas SÓLIDOS gerar lê com aumento e comprimentos curtos. O custo por megabases de sequência é muito mais baixa do que a plataforma 454. Devido ao grande número de curta lê para a Illumina e plataformas SÓLIDOS, análise de dados é muito mais computacionalmente intensivo. O preço do instrumento e reagentes para sequenciamento para a plataforma Ion Torrent é mais barato eo tempo de seqüenciamento é mais curto 25. No entanto, a taxa de erro e o custo por megabases de sequência são mais elevados em comparação com o Ilumina e plataformas SÓLIDOS. Plataformas diferentes têm suas próprias vantagens e desvantagens e exigem métodos diferentes para análise de dados. O plaTForm deve ser escolhido com base na finalidade de seqüenciamento e da disponibilidade de financiamento.
Neste artigo, tomamos plataforma Illumina RNA-Seq como um exemplo. Utilizou-se EML célula como um sistema modelo para investigar os reguladores-chave na EML celular auto-renovação e diferenciação, e fornecida uma métodos detalhados de construção da biblioteca de ARN-Seq e análise de dados para o cálculo do nível de expressão e detecção de novo transcrito. Temos mostrado na nossa publicação anterior que estudo RNA-seq no sistema modelo EML 2, quando acoplado com teste funcional (por exemplo, shRNA knockdown) proporcionar uma abordagem poderosa para compreender o mecanismo molecular dos primeiros estágios de diferenciação hematopoiética, e pode servir como um modelo para a análise de células de auto-renovação e diferenciação em geral.
Transcriptoma de mamíferos é muito complexo 34-38. Tecnologia de RNA-Seq desempenha um papel cada vez mais importante nos estudos de análise de transcriptoma, novela de detecção de transcrições e único nucleotídeo descoberta variação etc. Ele tem muitas vantagens sobre outros métodos de análise de expressão gênica. Como mencionado na introdução, que supera os artefactos de hibridação de microarray e pode ser utilizado para identificar novos transcritos de de novo. U…
The authors have nothing to disclose.
JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundation.
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | BHK cell culture |
Anti-Mouse CD34 FITC | eBioscience | 11-0341-81 | FACS sorting |
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | eBioscience | 12-5981-81 | FACS sorting |
APC Mouse Lineage Antibody Cocktail | BD Biosciences | 558074 | FACS sorting |
BD FACSAria Cell Sorter | BD Biosciences | Special offer sysmtem | FACS sorting |
Corning™ Cell Culture Treated Flasks 75cm2 | Corning incorporated | 430641 | Cell culture |
Corning™ Cell Culture Treated Flasks 25cm2 | Corning incorporated | 430639 | Cell culture |
Deoxyribonuclease I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068-015 | Library preparation |
DMEM | Invitrogen | 11965-092 | BHK cell culture |
DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
HI FBS | Invitrogen | 16140071 | BHK cell culture |
Horse Serum | Invitrogen | 16050-122 | EML cell culture |
IMDM | HyClone | SH30228.02 | EML cell culture |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Cell culture |
Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Isolation of lineage negative cells |
NanoVue Plus spectrophotometer | GE Healthcare | 28-9569-62 | Quality control |
Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Scientific | 15-497-002 | Cell culture |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | EML cell culture |
TRIzol® Reagent | Invitrogen | 15596-018 | RNA exraction |
TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn) | Illumina | RS-122-2002 | Library preparation |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939AA | Quality control |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | Cell culture |
0.45 µm Syringe Filters | Nalgene | 190-2545 | Cell culture |