Определение ключевых факторов, регулирующих самообновлению и дифференцировке в EML гемопоэтических клеток-предшественников по РНК секвенирования анализа
Summary
РНК-секвенирования и биоинформатики анализы были использованы для определения существенно и дифференцированно выраженные факторы транскрипции в субпопуляции Lin-CD34 + и Лин-CD34- из EMLcells мыши. Эти факторы транскрипции может играть важную роль в определении переключатель между самообновляющихся Lin-CD34 + и частично дифференцированные Лин-CD34- клеток.
Abstract
Гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) используются в клинике для лечения трансплантации для восстановления кроветворной системы пациента во многих заболеваний, таких как лейкоз и лимфома. Выяснение механизмов, контролирующих ГСК самообновление и дифференцировку важно для применения ГСК для исследований и клинического применения. Тем не менее, это не возможно, чтобы получить большое количество ГСК-за их неспособности к пролиферации в пробирке. Чтобы преодолеть это препятствие, мы использовали мозга получены линии клеток мыши кости, EML (эритроидных, миелоидный и лимфобластный) клеточной линии, в качестве модельной системы для данного исследования.
РНК-секвенирования (Секвенирование РНК) все чаще используется для замены микрочипов для исследований экспрессии генов. Мы сообщаем здесь подробный способ применения РНК-Seq технологию, чтобы исследовать потенциальные ключевые факторы в регуляции EML клеток к самообновлению и дифференцировке. Протокол предоставляется в данной работе, делится на три части. Первый номинальнаят объясняет, как культура EML клетки и отдельный Лин-CD34 + и Лин-CD34- клетки. Вторая часть протокола предлагает подробные процедуры для всего препарата РНК и последующего строительства библиотеки для высокой пропускной последовательности. Последняя часть описывает метод для анализа данных Секвенирование РНК и объясняет, как использовать полученные данные для выявления разному экспрессируются транскрипционные факторы между Лин-CD34 + и Лин-CD34- клеток. Наиболее существенно по-разному выраженные факторы транскрипции были определены как потенциальные ключевые регуляторы, контролирующие EML клеток к самообновлению и дифференцировке. В разделе обсуждения этого документа, мы выделяем ключевые шаги для успешного выполнения этого эксперимента.
Таким образом, этот документ предлагает способ использования РНК-Seq технологию для выявления потенциальных регуляторов самообновления и дифференцировки в EML клеток. Ключевыми факторами, выявленные подвергаются последующей функционального анализа в пробирке и Iн естественных условиях.
Introduction
Гемопоэтических стволовых клеток редкие клетки крови, которые находятся в основном в нише взрослого костного мозга. Они отвечают за производство клеток, необходимых для пополнения крови и иммунной систем 1. Как вид стволовых клеток, ГСК способны как самообновления и дифференцировки. Выяснение механизмов, которые контролируют решение судьбы ГСК, к любой самообновления или дифференциации, будет предлагать ценные указания на манипуляции ГСК для болезни крови исследований и клинического использования 2. Одна из проблем, с которой сталкиваются исследователи, что ГСК может поддерживаться и расширяться в пробирке в очень ограниченной степени; Подавляющее большинство их потомства частично дифференцированы в культуре 2.
В целях выявления ключевых регуляторов, которые управляют процессами самообновления и дифференцировки на генома масштабе, мы использовали мыши примитивный кроветворную линию клеток-предшественников EML в качестве модельной системы. Чтявляется клеточная линия была получена из мышиного костного мозга 3,4. Когда подается с различными факторами роста, EML клетки могут дифференцироваться в эритроидных, миелоидных и лимфоидных, клеток в пробирке 5. Важно отметить, что эта клеточная линия может распространяться в большом количестве в культуральную среду, содержащую фактор стволовых клеток (SCF) и до сих пор сохраняют свою мультипотентности. EML клетки могут быть разделены на субпопуляции самообновляющихся Лин-SCA + CD34 + и частично дифференцированы Лин-SCA-CD34- клеток, основанные на поверхностных маркеров CD34 и SCA 6. Подобно краткосрочного ГСК, SCA + CD34 + клеток способны к самообновлению. При обработке SCF, Лин-SCA + CD34 + клеток может быстро восстановить смешанную популяцию Лин-SCA + клеток CD34 + и Лин-SCA-CD34- и продолжают размножаться 6. Два популяции сходны по морфологии и имеют аналогичные уровни С-комплект мРНК и белка 6. Лин-SCA-CD34- клетки способны распространяющиеся в среде, содержащей IL-3, вместо SCF 3. Unveilinг ключевые регуляторы в клеточных судеб решения EML предложит лучшее понимание клеточных и молекулярных механизмов в начале переходного периода развития во кроветворения.
Для того чтобы исследовать основополагающие молекулярные различия между Самообновляющийся Лин-SCA + CD34 + и частично дифференцированных клеток Lin-SCA-CD34-, мы использовали Секвенирование РНК для идентификации разному экспрессируются гены. В частности, мы ориентируемся на транскрипционных факторов, как транскрипционные факторы имеют решающее значение в определении судьбы клеток. Секвенирование РНК является недавно разработанный подход, который использует возможности следующего поколения секвенирования (NGS) технологии для профилирования и количественно РНК транскрибируются с геном 7,8. Вкратце, тотальную РНК поли-выбран и фрагментарный как начальный шаблон template.The РНК затем превращают в кДНК с использованием обратной транскриптазы. Для отображения полнометражные РНК-транскриптов, используя нетронутыми, Неискаженный РНК для построения библиотеки кДНК важно. Для цепоза последовательности, специфические последовательности адаптера добавляются к обоим концам кДНК. Тогда, в большинстве случаев, молекулы кДНК амплифицировали с помощью ПЦР и секвенировали в высокой пропускной образом.
После секвенирования, то результат чтения может быть выровнен с опорным генома и базы данных транскриптома. Число считывает карту, что к опорному гена считается, и эта информация может быть использована для оценки уровня экспрессии гена. Читает также могут быть собраны заново без ссылки генома, что позволяет изучать transcriptomes в не-модельных организмов 9. Секвенирование РНК технология также используется для обнаружения сплайсинга изоформы 10-12 новых транскриптов генов 13 и 14 слияния. В дополнение к обнаружению белок-кодирующих генов, Секвенирование РНК также могут быть использованы для обнаружения нового и анализа уровня транскрипции некодирующих РНК, таких как длинные некодирующие РНК, микроРНК 15,16 17, 18 и т.д. миРНК. Из-за тон Точность этого метода, он был использован для детектирования единичных нуклеотидных вариаций 19,20.
До появления РНК-Seq технологии, микрочипов был основным методом для анализа профиля экспрессии генов. Предварительно предназначен зонды синтезировали и затем присоединены к твердой поверхности, чтобы сформировать микрочипов слайд 21. мРНК извлекают и превращают в кДНК. Во время обратного процесса транскрипции, флуоресцентно меченные нуклеотиды включены в кДНК и кДНК может быть гибридизации на микрочипе слайдов. Интенсивность сигнала, взятой в определенном месте, зависит от количества кДНК связывающего с зондом, специфичным на этом месте 21. По сравнению с РНК-Seq технологии, микрочипов имеет ряд ограничений. Во-первых, микрочипов опирается на уже существующей знания генной аннотации, в то время как Секвенирование РНК технология способна обнаруживать новые стенограммы при относительной высоком уровне фона, что ограничивает его применение когда GEпе уровень экспрессии является низким. Кроме того, Секвенирование РНК технология имеет много выше, динамический диапазон детектирования (8000 раз) 7, в то время как, из-за насыщения фона и сигналов, точность микрочипов ограничен для обоих весьма скромное и экспрессируемых генов 7,22. Наконец, микрочипов зонды отличаются их эффективности гибридизации, которые делают результаты менее надежны при сравнении относительных уровней экспрессии различных транскриптов в течение одного образца 23. Хотя Секвенирование РНК имеет много преимуществ по сравнению с микрочипом, ее анализ данных является сложным. Это одна из причин того, что многие исследователи все еще используют вместо микрочипов Секвенирование РНК. Различные инструменты биоинформатики необходимы для обработки и анализа 24 данных Секвенирование РНК.
Среди нескольких секвенирования следующего поколения (NGS) платформ, 454, Illumina, SOLID и Ion Torrent являются наиболее широко используемые из них. 454 была первой коммерческой платформы NGS. В отличие от других платформ секвенированиятаких как Illumina и SOLID, 454 платформы генерирует больше читать длина (в среднем 700 база читает) 25. Более читает лучше для начальной характеристике transcriptiome из-за их более высокой собрать эффективности 25. Основным недостатком в 454 платформе является его высокая стоимость Мегабазе последовательности. Illumina и SOLID платформы генерировать читает с увеличением числа и коротких длин. Стоимость одного Мегабазе последовательности значительно ниже, чем в 454 платформе. Из-за большого количества коротких читает для Illumina и твердых платформ, анализ данных намного более интенсивными вычислениями. Цена инструмента и реагентов для секвенирования на платформе Ion Torrent дешевле и время секвенирования короче 25. Тем не менее, частота ошибок и стоимость Мегабазе последовательности выше по сравнению с Illumina и твердых платформ. Различные платформы имеют свои преимущества и недостатки и требуют разных методов анализа данных. ПлаТГогт должны быть выбраны на основе цели секвенирования и наличия финансовых средств.
В этой статье, мы берем платформу Illumina Секвенирование РНК в качестве примера. Мы использовали EML клетку в качестве модельной системы для изучения ключевых регуляторов в EML клеток к самообновлению и дифференцировке, и при условии, подробные методы РНК-Seq строительства библиотеки и анализа данных для расчета уровня экспрессии и выявления новых транскриптов. Мы показали в нашей предыдущей публикации, что РНК-сл исследование в EML системы модели 2, в сочетании с функциональной пробы (например shRNA бросовой) обеспечить эффективный подход в понимании молекулярного механизма ранних стадиях кроветворной дифференциации, и может служить модель для анализа клеток к самообновлению и дифференцировке в целом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Млекопитающих транскриптомный является очень сложным 34-38. Секвенирование РНК технология играет все более важную роль в исследованиях анализа транскриптома, выявления новых транскриптов и открытия вариации одного нуклеотида и т.д. Она имеет много преимуществ по сравнен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundation.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | BHK cell culture |
| Anti-Mouse CD34 FITC | eBioscience | 11-0341-81 | FACS sorting |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | eBioscience | 12-5981-81 | FACS sorting |
| APC Mouse Lineage Antibody Cocktail | BD Biosciences | 558074 | FACS sorting |
| BD FACSAria Cell Sorter | BD Biosciences | Special offer sysmtem | FACS sorting |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 75cm2 | Corning incorporated | 430641 | Cell culture |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 25cm2 | Corning incorporated | 430639 | Cell culture |
| Deoxyribonuclease I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068-015 | Library preparation |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | BHK cell culture |
| DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
| HI FBS | Invitrogen | 16140071 | BHK cell culture |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050-122 | EML cell culture |
| IMDM | HyClone | SH30228.02 | EML cell culture |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Cell culture |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Isolation of lineage negative cells |
| NanoVue Plus spectrophotometer | GE Healthcare | 28-9569-62 | Quality control |
| Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Scientific | 15-497-002 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | EML cell culture |
| TRIzol® Reagent | Invitrogen | 15596-018 | RNA exraction |
| TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn) | Illumina | RS-122-2002 | Library preparation |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939AA | Quality control |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | Cell culture |
| 0.45 µm Syringe Filters | Nalgene | 190-2545 | Cell culture |
References
- Chambers, S. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential. Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS genetics. 8, (2012).
- Ye, Z. J., et al. Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).
- Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development. Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).
- Weiler, S. R., et al. D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells. Blood. 93, 527-536 (1999).
- Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Chu, Y., Corey, D. R. RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation. Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).
- Hornett, E. A., Wheat, C. W. Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species. BMC genomics. 13, 361 (2012).
- Eswaran, J., et al. RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations. Scientific reports. 3, 1689 (2013).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).
- Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing. Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).
- Edgren, H., et al. Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing. Genome biology. 12, 6 (2011).
- Ilott, N. E., Ponting, C. P. Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing. Methods. 63, 50-59 (2013).
- Sun, L., et al. Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study. BMC bioinformatics. 13, 331 (2012).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).
- Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection. BMC molecular biology. 11, 16 (2010).
- Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq. Nucleic acids research. 37, 106 (2009).
- Djari, A., et al. Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing. BMC genomics. 14, 307 (2013).
- Murphy, D. Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects. Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).
- Chen, K., et al. RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level. PLoS one. 8, 72567 (2013).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome research. 18, 1509-1517 (2008).
- Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. How to analyze gene expression using RNA-sequencing data. Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).
- Glenn, T. C. Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols. 7, 562-578 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature. 28, 511-515 (2010).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology. 11, 106 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Cheranova, D., et al. RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells. J Vis Exp. , (2013).
- Zhang, H. M., et al. AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database. Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).
- Wu, J. Q., et al. Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome. Genome Biol. 9, 3 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones. Biotechniques. 36, 690-696 (2004).
- Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing. Genome Res. 14, 665-671 (2004).
- Dewey, C., et al. Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat. Genome Res. 14, 661-664 (2004).
- Wu, J. . Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , (2011).
