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Bioengineering

के लिए एक उपकरण के रूप में एक लिपोसोमल-समझाया पास अवरक्त की fluorophore प्रतिदीप्ति शमन Published: January 5, 2015 doi: 10.3791/52136
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 2, 1
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital
* These authors contributed equally

Introduction

Liposomes अधिकता की जांच की और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों 1,2 के लिए सबसे biocompatible है जैव चिकित्सा दवा वितरण प्रणाली में से एक के रूप में काम किया गया है। वे मुख्य रूप से प्राकृतिक कोशिका झिल्ली के कुछ हिस्सों की नकल उतार biocompatible यौगिक होते हैं, जो दोनों के फॉस्फोलिपिड और कोलेस्ट्रॉल, से बना रहे हैं। हाइड्रोफिलिक पदार्थ जलीय इंटीरियर में फँस जा सकता है जबकि, lipophilic एजेंटों लिपोसोमल फॉस्फोलिपिड bilayer 3 में शामिल किया जा सकता है। Liposomes की जलीय इंटीरियर के भीतर पदार्थों के encapsulation विवो में गिरावट के खिलाफ संरक्षण देता है और यह भी ट्यूमर कोशिकाओं को नष्ट करने के उद्देश्य से उदाहरण केमोथेरापी के लिए रोगों के उपचार के लिए इस्तेमाल किया साइटोटोक्सिक दवाओं, के जहरीले प्रभाव से मेजबान सिस्टम को रोकता है। polyethylenglycol तरह पॉलिमर के साथ लिपोसोमल सतह के संशोधन (PEGylation) आगे के कारण sterical स्थिरीकरण से 4 विवो में लिपोसोमल रक्त परिसंचरण समय फैली हुई है। Moreovएर, liposomes ऐसे प्रोटीन 5,6, हाइड्रोफिलिक पदार्थ 7,8 और एंजाइमों 9 के रूप में कई पदार्थों की उच्च सांद्रता पृथक कर सकते हैं। वे इसलिए इस तरह के कैंसर के उपचार के लिए 4 डॉक्सोरूबिसिन रूप साइटोटोक्सिक दवाओं के वितरण के लिए उनकी मंजूरी योग्यता के रूप में जो विश्वसनीय नैदानिक ​​चिकित्सीय और नैदानिक ​​उपकरणों की सेवा। कारण उनके लचीलेपन के लिए, liposomes भी नैदानिक ​​और छवि निर्देशित शल्य चिकित्सा प्रयोजनों के लिए fluorochromes साथ लोड किया जा सकता है।

प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदान करता है एक लागत प्रभावी और हालांकि, कुछ बुनियादी आवश्यकताओं की मांग जो विवो नैदानिक ​​उपकरण में गैर इनवेसिव। यह vivo इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा सूट जो fluorochromes प्रकाश फैलाव और बिखरने के साथ ही पानी से होने वाले ऊतक autofluorescence और हीमोग्लोबिन कम है, जहां सीमा में विशेषता अवशोषण और उत्सर्जन Maxima है कि प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रकार, इस तरह के जांच के 650 और एनएम 10 900 के बीच उनके ABS / उन्हें Maxima है। Opsonization और तेजी से निकासी बहुत vivo इमेजिंग में 11 के लिए अपने आवेदन सीमित कर सकते हैं के रूप में इस के अलावा, इन विट्रो में और vivo में दोनों fluorochromes की स्थिरता, महत्वपूर्ण है। ऐसे गरीब स्थिरता और कम संवेदनशीलता या indocyanine ग्रीन (भारतीय तट रक्षक) 12-16 के साथ देखा के रूप में लक्ष्य अंगों पर साइटोटोक्सिक प्रभाव के रूप में अन्य प्रभाव, अवांछित हैं और vivo इमेजिंग के लिए जांच जब डिजाइनिंग को ध्यान में रखा जाना चाहिए। इन टिप्पणियों कई पूर्व नैदानिक ​​NIR fluorochromes, नैनोकणों के रूप में भी सूजन प्रक्रियाओं, कैंसर के vivo इमेजिंग के लिए और छवि निर्देशित सर्जरी 17-20 के लिए नई तकनीकों के सक्रिय विकास के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। सबसे preclinical NIRF (लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति) की स्थिरता के बावजूद रंगों में इन विट्रो, जिगर और गुर्दे के माध्यम से उनके तेजी से छिड़काव और निकासी की बीमारियों और सूजन प्रक्रियाओं के vivo ऑप्टिकल इमेजिंग में उनके उपयोग में बाधा।

ntent "> इसलिए हम जैसे fluorochromes की encapsulation के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत अच्छी तरह से विशेषता लगभग अवरक्त liposomes में अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता 21 पर आत्म-बुझाने के लिए अपनी प्रवृत्ति के लिए जाना जाता फ्लोरोसेंट रंजक डी वाई-676-COOH,। उच्च सांद्रता में एच डिमर गठन और / या गड़बड़ी-stacking, फ्लोरोफोरे अणुओं बढ़ जाती है के बीच कम एकाग्रता में। अंतरिक्ष fluorochrome के अणुओं के बीच Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) में एक-दूसरे के फोर्स्टर त्रिज्या परिणाम के भीतर स्थित फ्लोरोफोरे अणुओं के बीच बातचीत जिससे गड़बड़ी-स्टैकिंग बातचीत रोकने और एच-डिमर गठन और उच्च प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में जिसके परिणामस्वरूप। उच्च और निम्न एकाग्रता और साथ प्रतिदीप्ति शमन और सक्रियण के बीच स्विच ऑप्टिकल इमेजिंग 22 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक आशाजनक रणनीति है। NIRF डाई की उच्च सांद्रता का इस संबंध में, encapsulation के liposomes की जलीय इंटीरियर में वाई-676-COOH अधिक एफए हैमुक्त डाई से vivo इमेजिंग के लिए vorable। विधि की चुनौती डाई की उच्च सांद्रता encapsulating से परिणामी लाभ के सत्यापन में, दूसरी बात सही encapsulation में सब से पहले और निहित है। डाई की कम मात्रा के साथ एक गैर-बुझती liposome निर्माण के साथ भी मुक्त डाई के साथ कि बुझती liposomes की इमेजिंग गुणों की तुलना और अपरिहार्य है। हम liposomes में वाई-676-COOH का शमन सांद्रता के encapsulation संभव है कि वैकल्पिक फ्रीज और पिघलना चक्र के साथ संयुक्त एक सरल है, लेकिन अत्यधिक प्रभावी फिल्म जलयोजन और बाहर निकालना प्रोटोकॉल करके दिखाना। इस तरह के उलट चरण वाष्पीकरण विधि 23 के साथ ही इथेनॉल इंजेक्शन पद्धति के रूप में 24 liposomes तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है अन्य तरीकों कई हाइड्रोफिलिक पदार्थों के लिए उच्च encapsulation के क्षमता के साथ liposome तैयारी कर सकें। हालांकि, पदार्थ की प्रकृति encapsulation के दक्षता को प्रभावित कर सकते समझाया जाए। वास्तव में,यहाँ प्रस्तुत फिल्म जलयोजन और बाहर निकालना प्रोटोकॉल डी वाई-676-COOH के encapsulation के लिए उच्चतम क्षमता का पता चला। कुछ ही घंटों के भीतर सूजन प्रक्रियाओं का अध्ययन परमिट जो डी वाई-676-COOH, एक zymosan प्रेरित शोफ मॉडल की लिपोसोमल encapsulation का लाभ दर्शाते, इस्तेमाल किया गया था। यहाँ, यह समझाया डी वाई-676-COOH की उच्च सांद्रता के साथ liposomes मुक्त डाई या कम डाई सांद्रता के साथ गैर-बुझती लिपोसोमल तैयार करने से सूजन प्रक्रियाओं की विवो ऑप्टिकल इमेजिंग में पूरे शरीर के लिए अधिक उपयुक्त हैं कि प्रदर्शन किया है। इस प्रकार अंतर्निहित प्रोटोकॉल बुझती फ्लोरोसेंट liposomes और इन विट्रो में और vivo में दोनों अपने सक्रियण और इमेजिंग क्षमता का सत्यापन का उत्पादन करने के लिए एक सरल और तेज तरीका प्रदान करता है।

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Protocol

नोट: सभी प्रक्रियाओं क्षेत्रीय पशु समिति द्वारा और जानवरों के नैतिक उपयोग पर अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार अनुमोदित कर रहे हैं।

सामग्री और उपकरणों की 1. तैयारी

  1. अनायास गठन पुटिका फैलाव की तैयारी (SFV)
    1. निम्नलिखित फॉस्फोलिपिड का जायजा समाधान भंग और तैयार: 214 मिलीग्राम / एमएल अंडा Phosphatidylcholine (ईपीसी), 134 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल, 122 मिलीग्राम / एमएल 1,2-distearoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine- एन - [methoxy (पॉलीथीन ग्लाइकोल) -2000] (अमोनियम नमक) (एमपीईजी 2000 -DSPE) और 2 मिलीग्राम / एमएल 1,2-dioleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine- एन - (7-नाइट्रो-2-1,3-benzoxadiazol-4 कांच की शीशियों में क्लोरोफॉर्म और दुकान में -yl) (अमोनियम नमक) (NBD डोप)।
    2. एक दौर नीचे फ्लास्क में लगभग 3 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म सजाएं और ईपी से बना liposomes तैयार करने के दौर नीचे कुप्पी में फॉस्फोलिपिड शेयर समाधान की उचित मात्रा का स्थानांतरणसी: 3: 0.5 चोल: 6.5 की एक दाढ़ अनुपात में एमपीईजी 2000 -DSPE। Liposomes के दोहरे प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए लिपिड समाधान के लिए 0.3 मोल% NBD डोप जोड़ें।
    3. एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर 55 डिग्री सेल्सियस पर कम दबाव (300 मिलीबार) के तहत जैविक फॉस्फोलिपिड समाधान से क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना।
    4. एक सजातीय फॉस्फोलिपिड फिल्म का गठन किया है, के बाद अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म जमा दूर करने के लिए 1-2 घंटे के लिए 10 एम्बार करने के लिए दबाव कम।
    5. क्लोरोफॉर्म evaporating है, वहीं 10 मिमी Tris बफर 7.4 पीएच में वाई-676-COOH (6.181 माइक्रोन) को भंग करने और तरल नाइट्रोजन के साथ एक देवर पोत भरें। एक अल्ट्रासोनिक स्नान पर स्विच और 50 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित किया है।
    6. डी वाई-676-COOH (6.181 माइक्रोन) एक अनायास गठन पुटिका (SFV) फैलाव रूपों तक शुष्क फॉस्फोलिपिड फिल्म और सख्ती भंवर हाइड्रेट दौर नीचे कुप्पी का हल का एक उचित मात्रा (0.5-1 एमएल) के स्थानांतरण। फॉस्फोलिपिड के सभी लिपिड नुकसान से बचने के लिए बिखरे हैं कि सुनिश्चित करें।
    7. ध्यान से टीआरएnsfer दौर नीचे तरल नाइट्रोजन में SFV फैलाव युक्त कुप्पी और 3-5 मिनट के लिए फैलाव फ्रीज। फिर फैलाव पिघलना 1-2 मिनट के लिए सख्ती फैलाव भंवर 50 डिग्री सेल्सियस पर एक अल्ट्रासोनिक स्नान में दौर नीचे कुप्पी रखें। सात फ्रीज और पिघलना चक्र की कुल बना, इस प्रक्रिया में छह बार दोहराएँ।
  2. SFV के बाहर निकालना सजातीय liposome पुटिकाओं के लिए फार्म
    1. 1 मिलीलीटर सिरिंज (सिरिंज-ए) में SFV फैलाव स्थानांतरण और सिरिंज-बी में एक LiposoFast-बेसिक extruder उपयोग एक 100 एनएम पॉली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से फैलाव बाहर निकालना।
    2. वापस सिरिंज-एक में, सिरिंज-बी से फैलाव बाहर निकालना है, तो चक्र दस बार दोहराएँ। कारण बाहर निकालना के लिए, समय के साथ एक स्पष्ट फैलाव को एक धुंधला उपस्थिति से सिरिंज परिवर्तन में समाधान। दस चक्र (बीस एकल बाहर निकालना कदम) डिवाइस से सिरिंज-बी को हटाने और एक बाँझ में सिरिंज-एक सीधे से पिछली बार के लिए फैलाव बाहर निकालना के बाद1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब।
  3. लिपोसोमल का शोधन मुक्त डाई से डी वाई-676-COOH समझाया
    1. 10 मिमी Tris बफर 7.4 पीएच (स्तंभ की लंबाई 28 सेमी, व्यास 0.8 सेमी) में भिगो G25 के मनकों का उपयोग कर एक जेल क्रोमैटोग्राफी स्तंभ तैयार करें।
    2. जेल मैट्रिक्स में नमूना नाली जेल बिस्तर पर extruded पुटिका फैलाव के 0.5 एमएल हस्तांतरण और दें।
    3. 10 मिमी Tris बफर 7.4 पीएच (चित्रा 1 ए) के साथ liposomes elute और स्तंभ के बाहर पूरी तरह से मुक्त डाई नालियों तक स्तंभ धो लें। अगर जरूरत हो, इकट्ठा करने और निर्माता के निर्देशों के अनुसार desalting और निर्जलीकरण से मुक्त डाई रीसायकल।
    4. फिर 10 बाँझ मिमी Tris बफर पीएच, 7.4 की पर्याप्त मात्रा में उन्हें फैलाने ultracentrifugation (200,000 XG, 8 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा) द्वारा eluted liposomes ध्यान लगाओ।
  4. समझाया डी वाई-676-COOH एकाग्रता की मात्रा का ठहराव
    1. डी वाई-676-COOH (0, 82, 124 भंग करके एक अंशांकन वक्र तैयार करें,10 मिमी Tris बफर में 247, 494, 988 एनएम), 7.4 पीएच 0.1% ट्राइटन X100 युक्त।
    2. पुटिकाओं को नष्ट करने और समझाया डाई रिलीज करने के लिए 1% ट्राइटन X100 युक्त 100 μl Tris बफर में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए liposomes के 2 μl (एक 50 mmol / एल शेयर के 100 nmol अंतिम लिपिड) भंग। फिर 0.1% की एक अंतिम ट्राइटन-X100 के एकाग्रता के लिए 10 मिमी Tris बफर, पीएच 7.4 के साथ नमूने पतला (वी / वी) 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा बना रही है। दो प्रतियों में सभी नमूनों को तैयार है।
    3. एक उत्तेजना λ = 645 एनएम और एक उत्सर्जन λ = 700 एनएम पर अवशोषण और उत्सर्जन सभी नमूनों की (मुक्त वाई-676-COOH और ट्राइटन-X100 के इलाज किया liposomes) को मापने। स्थापना और समझाया डाई की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए स्वतंत्र डाई की एक अंशांकन वक्र का उपयोग करें।
  5. Liposome लक्षण वर्णन
    1. गतिशील प्रकाश बिखरने से liposomes के आकार और जीटा क्षमता का निर्धारण। एसी के लिए निष्फल फिल्टर (0.2 माइक्रोन) 10 मिमी Tris बफर 7.4 पीएच के साथ लिपोसोमल नमूने पतला100-300 माइक्रोन (लिपिड) के oncentration। एक कम मात्रा डिस्पोजेबल क्युवेट में पतला नमूने स्थानांतरण और निर्माता के निर्देशों के अनुसार नमूना उपाय।
    2. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार लिपोसोमल vesicles के आकार, अखंडता और एकरूपता को पुष्ट करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा liposomes विशेषताएँ।

2. प्रतिदीप्ति शमन के मान्यकरण और तैयार Liposomes का एक्टिवेशन

  1. प्रतिदीप्ति शमन और सक्रियण के भौतिक विश्लेषण
    1. लिप-क्यू के लिए दो 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और मुफ्त वाई-676-COOH के लिए दो ट्यूबों तैयार। स्थानांतरण 100 nmol कुल लिपिड इसी ट्यूबों में (समझाया डी वाई-676-COOH के 138 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर से युक्त एक 42 mmol / एल लिप-क्यू शेयर समाधान के 2.38 μl)। लिप-क्यू की डाई सामग्री (138 माइक्रोग्राम प्रति / 1,000 μl इस्तेमाल किया लिप-क्यू μl एक्स 2.38 से उदाहरण के लिए जो परिणाम 0.38 माइक्रोग्राम प्रति) के लिए स्वतंत्र डी वाई-676-COOH के बराबर स्थानांतरण। एक टब सेते4 डिग्री सेल्सियस पर हर जांच के ई और -80 डिग्री सेल्सियस रातोंरात (16 घंटा) में दूसरी ट्यूब फ्रीज।
    2. 30 डिग्री सेल्सियस के लिए एक हीटिंग ब्लॉक गर्मी। कुचल बर्फ के साथ एक शीतलन बॉक्स भरें और कमरे के तापमान को 10 मिमी Tris बफर 7.4 पीएच की एक विभाज्य संतुलित करना।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस से जांच निकालें और 5 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर -80 डिग्री सेल्सियस से जांच (प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा) और जल्दी गल कमरे के तापमान पर संतुलित करना। (यह भी प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा) कमरे के तापमान के लिए उन्हें स्थानांतरित करने से पहले एक मिनट के लिए बर्फ पर thawed जांच टेंशन मत लो।
    4. 100 μl अंतिम मात्रा को जांच से प्रत्येक के लिए 10 मिमी Tris बफर (7.4 पीएच) जोड़ें और 10 मिनट के लिए आरटी पर सारे जांच संतुलित करना।
    5. पिपेट 80 एक कम मात्रा कांच क्युवेट में हर जांच के μl और एक स्पेक्ट्रोमीटर पर 400-900 एनएम से हर जांच के अवशोषण को मापने। उनके इसी ट्यूबों के लिए जांच लौटें।
    6. एक उपयुक्त कांच क्युवेट में हर जांच के 80 μl स्थानांतरणऔर 674 एनएम पर रोमांचक जांच करके एक spectrofluorometer पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन मापने के लिए और 694-800 एनएम से प्रतिदीप्ति मापने।
  2. सेलुलर तेज और प्रतिदीप्ति सक्रियण
    1. मानक स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 95% humidified माहौल) के अनुसार उनके इसी संस्कृति मीडिया में निम्नलिखित सेल लाइनों जाओ और संस्कृति। इधर, murine बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन J774A.1 उपयोग (Dulbecco बार ईगल मध्यम 10% (वी / वी) भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक संशोधित), मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन, यू-118MG (आवश्यक विटामिन और 10% से युक्त सदस्य (वी / v) के भ्रूण बछड़ा सीरम) और मानव fibrosarcoma सेल लाइन, एचटी-1080 (5% एफसीएस साथ RPMI)।
    2. पाली एल Lysine के साथ कोट 8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स (अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl 0.001% पाली एल Lysine जोड़ने के लिए और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। महाप्राण समाधान और चैम्बर स्लाइड्स में कम से कम 4 के लिए सूख जाने एक बाँझ कार्यक्षेत्र पर आरटी पर घंटा। चैम्बर स्लाइड्स कुल्ला 3जरूरत तक 200 μl हांक बफर खारा समाधान के साथ कई बार तो 4 डिग्री सेल्सियस पर आयल और एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ उन्हें सील।
    3. चैम्बर स्लाइड्स सूख रहे हैं, जबकि जरूरत तक, 4 डिग्री सेल्सियस पर liposomes और डाई समाधान और दुकान फिल्टर बाँझ।
    4. विवो NIR प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली में पूरे शरीर के साथ जांच तेज विश्लेषण के लिए तीन परीक्षण सेल लाइनों से प्रत्येक के लिए 5 छोटे संस्कृति बोतल (कुल 15 बोतल) तैयार करते हैं। बीज 2 एक्स 10 6 J774A.1, यू-118MG और (quintuples में) संबंधित संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीलीटर के साथ संस्कृति कुप्पी प्रति एचटी-1080 कोशिकाओं और 16-24 घंटे के लिए बढ़ता है। , संस्कृति बोतल के समानांतर क्रमशः चैम्बर स्लाइड के दो कुओं के लिए प्रत्येक कोशिका लाइन (J774A.1 और एचटी-1080) या 20,000 कोशिकाओं (यू-118MG) के 30,000 कोशिकाओं बीज और 16-24 घंटे के लिए 500 μl संस्कृति माध्यम में हो जाना ।
    5. अगले दिन, सेल प्रति पंक्ति और चैम्बर स्लाइड पर प्रत्येक कोशिका लाइन की एक अच्छी तरह से करने के लिए 2 बोतल के होंठ-क्यू के 100 nmol (अंतिम लिपिड राशि) जोड़ें।इसके तत्काल बाद एक 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेल लाइन प्रति फ्लास्क और वापस इनक्यूबेटर करने के लिए दूसरा कुप्पी हस्तांतरण।
      नोट: चैम्बर स्लाइड्स पर एकाग्रता, जिससे जांच की मात्रा बोतल में जोड़ा और चैम्बर स्लाइड वही कर रहे हैं 10 गुना अधिक (5 एमएल 500 μl संस्कृति के माध्यम से होता है)। सूक्ष्म पता लगाने बोतल से सेल छर्रों imaged हैं जहां NIR प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली की तुलना में कम संवेदनशील है क्योंकि यह आवश्यक है।
    6. सेल प्रति पंक्ति और चैम्बर स्लाइड पर प्रत्येक कोशिका लाइन की एक अच्छी तरह से करने के लिए दो बोतल में कोशिकाओं को लिप-क्यू की डाई सामग्री के लिए एक एकाग्रता के बराबर में मुफ्त वाई-676-COOH जोड़ें, तो तुरंत सेल प्रति पंक्ति एक कुप्पी हस्तांतरण 4 डिग्री सेल्सियस (ऊर्जा की कमी) और वापस इनक्यूबेटर चैम्बर स्लाइड के साथ साथ अन्य फ्लास्क। इसी स्थिति में 24 घंटे के लिए सभी कोशिकाओं को सेते हैं। जांच के बिना फ्लास्क में कोशिकाओं के रूप में अनुपचारित नियंत्रण सेवा करते हैं।
  3. NIRF इमेजिंग और अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण
    1. 24 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद, हैंक्स के साथ कोशिकाओं को 2 बार धोने से बोतल में कोशिकाओं फसल 500 μl ट्यूबों में नमक समाधान (HbSS) तो centrifugation (200 XG पर 5 मिनट) द्वारा 500 μl HBSS में कोशिकाओं और गोली परिमार्जन बफर।
    2. उत्तेजना (615-665 एनएम) और उत्सर्जन (> 700 एनएम में कटौती) के लिए सेल छर्रों (और HbSS) एक NIRF इमेजर में और छवि का उपयोग फिल्टर के साथ ट्यूबों रखें।
    3. Autofluorescence घटा देते हैं और निर्माता के निर्देशों के अनुसार autofluorescence बनाम लक्ष्य की तीव्रता का मूल्यांकन। यह माप एक दूसरे के बीच तुलना कर रहे हैं, इसलिए है कि जोखिम समय, कैमरा लाभ, binning और थोड़ी गहराई के लिए स्केलिंग के बाद गिनती के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है जो औसत संकेत के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता (पहुंचा मायने रखता है / सेक), के लिए अर्द्ध मात्रात्मक स्तर को दे देंगे।
  4. Confocal सूक्ष्म विश्लेषण
    1. 24 घंटा ऊष्मायन के बाद, 500 μl HBSS के साथ 2 बार धोने से चैम्बर स्लाइड पर कोशिकाओं फसल।
    2. सीई फिक्स200 μl HBSS के आरटी पर 30 मिनट के लिए 3.7% (वी / वी) formaldehyde को रोकने के साथ LLS।
    3. निर्धारण पर जा रहा है, वहीं डीएनए दाग बढ़ते समाधान के साथ, हेक्स्ट-33,258 01:50 पतला।
    4. निर्धारण के बाद, फिर HBSS के साथ कोशिकाओं को दो बार धो गिलास स्लाइड से कक्षों अलग। चैम्बर स्लाइड्स के कुओं के लिए इसी प्रत्येक स्थान पर डीएनए दाग युक्त 50 μl बढ़ते समाधान जोड़ें। आर टी (अंधेरे) में पारदर्शी नेल पॉलिश और हवा शुष्क 10 मिनट के लिए साथ किनारों को सील, कांच coverslips के साथ कोशिकाओं को कवर किया।
    5. एक उपयुक्त प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी या confocal खुर्दबीन पर छवि कोशिकाओं। नाभिक (हेक्स्ट-33,258: उत्तेजना 405 एनएम, उत्सर्जन 420-480 एनएम) इसी घटकों के दृश्य के लिए निम्नलिखित उत्तेजना और उत्सर्जन सेटिंग्स का उपयोग करें। NBD डोप (लिपोसोमल लिपिड: उत्तेजना 488 एनएम, उत्सर्जन 530 एनएम)। डी वाई-676-COOH (NIR फ्लोरोसेंट रंजक: उत्तेजना 633-645 एनएम, उत्सर्जन 650-700 एनएम)।
      नोट: सुनिश्चित करें कि प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी एकvailable उच्चतर 630 एनएम से तरंग दैर्ध्य की उत्तेजना और उत्सर्जन की अनुमति है, जो उपयुक्त फिल्टर से लैस है।

3. सूजन के vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग में Liposome आधारित

  1. जानवरों और सामग्री की तैयारी
    1. हाउस 8-12 सप्ताह पुराने भोजन और पानी यथेच्छ के साथ मानक शर्तों के तहत लगभग 36 ग्राम वजन पुरुष NMRI चूहों।
    2. सात दिन पहले प्रयोगों के शुरू करने के लिए, ऊतक autofluorescence को कम करने के क्रम में सभी चूहों एक कम pheophorbide आहार दे।
    3. चौबीस घंटे प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत से पहले, वांछित क्षेत्र में चूहों दाढ़ी (जैसे, हिंद पैर शोफ की इमेजिंग वांछित है अगर पूरी पीठ क्षेत्र)।
    4. जानवरों के वजन और जांच की राशि की गणना लिप-क्यू का इस्तेमाल किया की सामग्री डाई करने के लिए वजन और मुफ्त वाई-676-COOH (समकक्ष प्रति किलो) 10 μmol (लिपिड एकाग्रता पर माउस (लिप-क्यू और लिप-dQ प्रति इंजेक्ट किया जा सकता है) ।
    5. छवि पशुओं मेंसेल छर्रों के लिए प्रयोग किया जाता है उसी रूपरेखा के साथ एक पूरे शरीर की NIR प्रतिदीप्ति इमेजर। यह माप जानवरों की autofluorescence प्रदान करता है।
    6. 1 मिलीलीटर में isotonic खारा समाधान 10 मिलीग्राम zymosan-एक भंग और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात दुकान।
  2. सूजन की और इन विवो NIRF इमेजिंग में प्रेरण
    1. निम्नलिखित समाधान युक्त माउस प्रति 3 सीरिंज तैयार करें। 50 μl zymosan-एक समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) और 50 μl isotonic खारा समाधान के साथ दूसरे सिरिंज के साथ एक सिरिंज भरें। नियंत्रण जानवरों के लिए लिप-क्यू और लिप-dQ (10 μmol / किलो वजन (लिपिड)) (लिप-क्यू के रूप में एकाग्रता) परीक्षण जानवरों और मुफ्त वाई-676-COOH के लिए नामित कर रहे हैं जिससे जांच, साथ तीसरे सिरिंज भरें। जांच में 150 μl अंतिम मात्रा करने के लिए बाँझ HBSS के साथ पतला कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
    2. (सूखापन से बचने और वे गहराई से सो रहे हैं जब तक दो isoflurane% के साथ पशुओं anesthetize और पंजे पर छुआ जब कोई प्रतिक्रिया नहीं करते के लिए जानवरों की आंखों पर नेत्र क्रीम लगाओइस) के बारे में दो मिनट लगते हैं।
    3. (अभी भी संज्ञाहरण के तहत) एक गर्म चटाई पर माउस प्लेस और सही हिंद पैर पर zymosan-ए समाधान subcutaneously और बाईं हिंद पैर पर खारा समाधान इंजेक्षन। (टी 0 घंटा = के रूप में) इंजेक्शन / मापन के रिकार्ड समय के तुरंत नसों के द्वारा जांच इंजेक्षन और फिर उसके बाद छवि जानवर। छवि क्यूब्स के रूप में जिसके परिणामस्वरूप छवियों को बचाने और अन्य सभी जानवरों और संबंधित जांच के लिए ऊपर के चरणों को दोहराएँ।
    4. छवि जानवरों को मापने के चैंबर के चरण (उदाहरण के लिए, नीचे एक गर्म चटाई रखकर) गर्म है सुनिश्चित करते हुए कि हर 10 घंटे बाद इंजेक्शन के लिए 2 घंटा और फिर 24 घंटे बाद इंजेक्शन, हाइपोथर्मिया से बचने के क्रम में। प्रत्येक माप के बाद, भोजन और पानी यथेच्छ के साथ एक पिंजरे में जानवरों जगह और एक शीतोष्ण पशु कक्ष में पिंजरे जगह है। जानवरों अब छूने की प्रतिक्रिया तक, फिर, 5-10 मिनट के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के साथ euthanize बनाने दो isoflurane% के साथ पहली anesthetizing के द्वारा जानवरों Euthanizeयकीन है कि जानवरों को पूरी तरह से साँस लेने में बंद करो और कठोरता के क्षण होता है।
    5. मानक ऑनलाइन मूल्यांकन किया जा सकता है, जो प्रोटोकॉल (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) और छवि अंगों के अनुसार चूहों काटना।
    6. पहले जानवर (unmixing) (नमक के साथ हिंद पैर बाएं) autofluorescence के लिए ब्याज और सूजन क्षेत्र का लक्ष्य प्रतिदीप्ति (zymosan-ए के साथ सही हिंद पैर) के तत्कालीन बताए क्षेत्रों के समग्र प्रतिदीप्ति की कटौती से निर्माता के निर्देशों के अनुसार माप परिणामों का मूल्यांकन।

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Representative Results

ऐसे liposomes की जलीय इंटीरियर में यहां इस्तेमाल किया NIRF डाई DY676-COOH के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों की उच्च सांद्रता के encapsulation प्रतिदीप्ति शमन के एक उच्च स्तर की ओर जाता है। प्रतिदीप्ति शमन, उच्च एकाग्रता में कई fluorophores के साथ देखा एक घटना है, लक्षित क्षेत्र के एक उच्च संवेदनशीलता और विश्वसनीय का पता लगाने की मांग कर रहे है, जहां vivo इमेजिंग अनुप्रयोगों में कई में शोषण किया जा सकता है। liposomes का उपयोग भी इन विवो अनुप्रयोगों के लिए अपरिहार्य है जो डाई की सुरक्षा प्रदान करता है। Liposomes की एक पूरी तरह लक्षण वर्णन आवश्यक है और ऐसे में vivo इमेजिंग प्रयोजनों के लिए डाई समझाया, स्थिरता और liposomes के आकार, प्रतिदीप्ति शमन और इन विट्रो में समझाया डाई की गतिविधि और भी प्रयोज्यता के स्तर के रूप में कई कारकों में शामिल हैं। मुक्त डाई की एक तुलना, डी वाई-676-COOH और बुझती liposomes (लिप-क्यू) के रूप में भी बहुत कम एकाग्रता के साथ एक गैर-बुझती liposome (लिप-DQ)समझाया डाई का राशन विशेष रूप से इन विवो अभिलक्षण के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है।

बाहर निकालना से पहले लगातार स्थिर और पिघलना चक्र के साथ फिल्म जलयोजन और बाहर निकालना तकनीक का उपयोग करके तैयार liposomes तेजी से elute जो liposomes (की तुलना में, सफलतापूर्वक जेल निस्पंदन मैट्रिक्स में उनके लंबे समय तक बनाए रखने के लिए कारण liposomes से अलग किया जा सकता है, जो अवशिष्ट मुक्त डाई अणु होते हैं चित्रा 1 बी)। जेल छानने के बाद कमजोर पड़ने के स्तर पर निर्भर करता है, एक वैकल्पिक ultracentrifugation कदम (चित्रा 1C) के रूप में सचित्र liposomes की एकाग्रता सक्षम बनाता है। समझाया डाई के अवशोषण और उत्सर्जन गुणों के आधार पर, समझाया डाई की एकाग्रता मुक्त डाई (चित्रा -1) के एक अंशांकन वक्र की मदद से निर्धारित किया जाता है। समझाया डाई की एकाग्रता के अलावा, यह liposomes पिछाड़ी के आकार और एकरूपता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैएर तैयारी। चित्रा 1E में देखा, अंतर्निहित विधि द्वारा तैयार liposomes की इलेक्ट्रॉन micrographs intravesicular डी वाई-676-COOH युक्त, शमन एकाग्रता सीमा के भीतर (लिप-क्यू या तो लिपोसोमल vesicles के एक ज्यादातर unilamellar आकारिकी पता चलता है, 606-846 माइक्रोन डी वाई-676 ) या गैर-बुझती डाई एकाग्रता (लिप-dQ पर, 25 माइक्रोन डी वाई-676)। इसके अलावा, वे अब तक 1 (तालिका 1) से नीचे के बारे में 120 एनएम और polydispersity सूचकांकों का एक समरूप आकार के वितरण प्रकट करते हैं। प्रतिदीप्ति शमन के कारण, लिप-क्यू एक शिखर नीले रंग तरंग दैर्ध्य की दिशा में एक पारी के द्वारा होती है जिससे जलीय बफर में दो अवशोषण Maxima को दिखाती है। इस के साथ लाइन में, प्रतिदीप्ति उत्सर्जन मुक्त डाई (2A चित्रा और बी, सही) की तुलना में बहुत कम है। आसपास के समाधान में पतला हो जाता है, जो डाई, की रिहाई में liposomes परिणामों की क्षति रुक। नीली स्थानांतरित कर दिया अवशोषण शिखर इसलिए डिsappears, लिप-क्यू के एक एकल अवशोषण शिखर में जिसके परिणामस्वरूप। इस के लिए इसी फ्रीज क्षतिग्रस्त लिप-क्यू के प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि जारी की डाई अणु की कि प्रतिदीप्ति सक्रियण जगह ले ली, जो इंगित करता देखा जाता है। मुक्त डाई भले ही ठंड (2A चित्रा और बी, बाएं) का एक ही स्तर पर बने हुए हैं जो केवल एक ही अवशोषण अधिकतम और उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता, पता चलता है। पर्यावरण से डाई की रक्षा के उच्च एकाग्रता और जुड़े प्रतिदीप्ति शमन बनाए रखने और लक्ष्य ट्रिगर्स से सक्रिय अगर प्रतिदीप्ति में वृद्धि के कारण का पता लगाने के लिए सक्षम होगा होगा लिप-क्यू के रूप में यह निष्कर्ष, liposomes में डाई की कि encapsulation के चलता है।

अंतर्निहित लिपिड रचना के साथ लिपोसोमल जांच ऊर्जा की कमी से हिचकते हैं, जो एक प्रमुख phagocytic तेज प्रकट करते हैं। यह बेहद phagocytic murine बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन J774A.1 से लिप-क्यू के तेज के माध्यम से देखा है, और किया जा सकता हैहल्का phagocytic मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन यू-118MG 37 डिग्री सेल्सियस और निषेध 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3 ए और बी) पर। मुक्त डाई डी वाई-676-COOH phagocytic सेल लाइनों में दोनों 37 डिग्री सेल्सियस और लिपोसोमल जांच लिप-क्यू के समाधान में कोई अवशिष्ट मुक्त डाई शामिल है और सक्रिय तेज केवल गुजरना कर सकते हैं इंगित करता है कि जो चार डिग्री सेल्सियस पर तेज पता चलता है। लेजर confocal स्कैनिंग सूक्ष्म छवियों आगे phagocytic कोशिकाओं (चित्रा -3 सी) में लिप-क्यू के तेज और सक्रियण को पुष्ट। इसके अलावा, गैर phagocytic मानव fibrosarcoma सेल लाइन में प्रतिदीप्ति की कमी है, एचटी-1080 phagocytic monocytes / मैक्रोफेज शामिल कर रहे हैं, जहां सूजन की इमेजिंग के लिए उपयुक्त होगा, लिप-क्यू के तेज मुख्य रूप से phagocytosis द्वारा और इस प्रकार है कि इंगित करता है।

सुसंस्कृत सेल लाइनों में देखा liposomes की phagocytic तेज के अनुरूप, और एक समय के लिए लिप-क्यू सुराग की नसों में इंजेक्शन शमन प्रतिदीप्ति के कारणबहुत कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के साथ चूहों मॉडल में शोफ (चित्रा -4 ए, लिप-क्यू) के प्रतिदीप्ति तीव्रता में निर्भर वृद्धि हुई है,। शोफ की अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता लिप-क्यू के 8-10 घंटे बाद इंजेक्शन का पता चला है। पूरे माउस के विपरीत, अपेक्षाकृत मजबूत NIR के प्रतिदीप्ति मुक्त वाई-676-COOH (चित्रा -4 ए, डी वाई-676-COOH) या हमेशा पर Liposome, लिप-dQ (चित्रा -4 ए, लिप-dQ के आवेदन के बाद देखा जाता है )। शोफ के विश्वसनीय पहचान (चित्रा -4 ए, डी वाई-676-COOH के लिए संभव नहीं है, इसलिए है कि 0-4 घंटे बाद इंजेक्शन से देखा के रूप में लिप-क्यू, तेजी से छिड़काव और मुफ्त वाई-676-COOH की निकासी की तुलना में, इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप )। इसके अलावा, गैर-बुझती Liposome, लिप-dQ 8 घण्टे तक लगभग स्थिर बनी हुई है, जो 2-4 घंटे बाद इंजेक्शन भीतर शोफ की एक अधिकतम प्रतिदीप्ति का पता चलता है, तो धीरे-धीरे बुझती लिप-क्यू-आधारित शोफ प्रतिदीप्ति के समान कम हो जाती है। अर्द्ध मात्रात्मक गुदा प्रदर्शनyses, हित के क्षेत्रों (ROIs) पृष्ठभूमि बनाम शोफ के लिए सेट कर रहे हैं, जिसके तहत एक अलग जांच के साथ पता लगाने के विभिन्न स्तरों के बारे में निष्कर्ष बना सकते हैं। समूह (जांच) के अनुसार 5 पशुओं की अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के अनुसार, शोफ (पी = 0.001) मुफ्त वाई-676-COOH या गैर-बुझती, लिप-dQ साथ की तुलना में लिप-क्यू के साथ पाया (चित्रा अधिक महत्वपूर्ण हो सकता है 4 बी)।

चूहों की इमेजिंग अंगों जांच के 24 घंटे बाद इंजेक्शन उन्मूलन के लिए साक्ष्य के रूप में कार्य करता है जो जिगर / पित्ताशय और गुर्दे और एक बहुत कम या तिल्ली का कोई प्रतिदीप्ति, फेफड़े और दिल (चित्रा 5), के हल्के पूर्व vivo प्रतिदीप्ति पता चलता है euthanized Hepatobiliary मार्ग के माध्यम से जांच की।

चित्रा 1
चित्रा 1: डी वाई-676-COOH से भरी हुई liposome की तैयारीएस। (एसी) शामिल संश्लेषण कदम की योजनाबद्ध सिंहावलोकन। (ए) के निकट अवरक्त डाई डी वाई-676-COOH के साथ फिल्म जलयोजन और बाहर निकालना के सेटअप। (बी) interphase दिखा स्वयं बनाया जेल निस्पंदन की स्थापना के चित्र गैर समझाया (मुक्त) डाई और liposomes के बीच। Liposomes पहले elute और वजह से समझाया डी वाई-676-COOH (नीला) के लिए नीले, हरे दिखाई देते हैं और निगमित हरी फॉस्फोलिपिड, NBD डोप। (सी) liposome-तलछट (लिप-क्यू) के प्रतिनिधि छवि ultracentrifugation द्वारा एकाग्रता के बाद। ( डी) लिपोसोमल डाई की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया 10 मिमी Tris 7.4 पीएच (1% ट्राइटन X100 युक्त)। (ई) लिप-क्यू के क्रायो-संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में वाई-676-COOH के प्रतिनिधि अंशांकन वक्र। देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।


चित्रा 2:। विट्रो में प्रतिदीप्ति शमन और सक्रियण के भौतिक दृढ़ संकल्प लिप-क्यू (दाएं) और (ए) अवशोषण स्पेक्ट्रा मुक्त वाई-676-COOH 10 मिमी Tris बफर 7.4 पीएच में मापा जाता है (बाएं), से पहले या कम से ठंड के बाद - 80 डिग्री सेल्सियस। । नि: शुल्क वाई-676-COOH और लिप-क्यू के फ्रीज क्षति के बाद नीली स्थानांतरित कर दिया चोटी के लापता होने की तुलना में लिप-क्यू की विशेषता डबल चोटी नोट (बी) (दाएं) लिप-क्यू के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा इसी के नि: शुल्क वाई-676-COOH (बाएं) से पहले या -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड के बाद 10 मिमी Tris बफर 7.4 पीएच में मापा जाता है।

चित्रा 3
चित्रा 3: होंठ के सेलुलर तेज और प्रतिदीप्ति सक्रियण osomes। में छवियों (ए) ने संकेत तापमान पर 24 घंटे के लिए इसी जांच के लिए जोखिम के बाद सेल छर्रों का NIR प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा तैयार किए गए थे। एचटी-1080 कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा ऊष्मायन अवधि जीवित नहीं किया। (बी) में बार चित्र हर बार एसडी ± एन = 3 प्रयोगों की औसत तीव्रता अर्थ ए में सेल छर्रों को ROIs के बताए द्वारा मिला प्रतिदीप्ति संकेतों के अर्द्ध मात्रात्मक स्तरों प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) में छवियां 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए संस्कृति कक्ष स्लाइड्स पर जांच के संपर्क में कोशिकाओं की लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा हासिल किया गया। उच्च phagocytic murine बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन J774A.1 में प्रतिदीप्ति के उच्च स्तर और हल्के phagocytic मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन यू-118MG में उदारवादी प्रतिदीप्ति ध्यान दें। गैर phagocytic मानव fibrosarcoma सेल लाइन एचटी-1080 जांच का कोई प्रतिदीप्ति पता चलता है। NBD डोप: हरी फ्लोरोसेंट फॉस्फोलिपिड।लोड / 52,136 / 52136fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चूहों में zymosan प्रेरित शोफ की विवो ऑप्टिकल इमेजिंग में चित्रा 4। (ए) छोड़ दिया पर माउस तस्वीर subcutaneously के पदों zymosan-ए (500 माइक्रोग्राम प्रति μl खारा 50) और नियंत्रण खारा समाधान लागू किया दिखाता है (50 μl) बायीं ओर पर। संकेत समय बिंदुओं पर संकेत दिया जांच और पूरे शरीर की NIR प्रतिदीप्ति इमेजिंग की नसों में इंजेक्शन क्रमिक पता चलता है, लेकिन आठ घंटे बाद इंजेक्शन पर अधिकतम प्रतिदीप्ति के साथ लिप-क्यू (ऊपरी पैनल) की शोफ और कम पृष्ठभूमि संकेतों के प्रतिदीप्ति संकेतों में उच्च वृद्धि हुई है। मुक्त डाई 4 घंटा पद इंजेक्शन के भीतर छिड़काव और तेजी से निकासी (मध्य फलक का पता चलता हैएल), लिप-dQ कम संकेत तीव्रता और एक समग्र उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति साथ शोफ का पता लगाने का पता चलता है, जबकि। (बी) में चित्रमय प्रस्तुति एन में नियंत्रण क्षेत्र (खारा) = समूह प्रति 5 पशुओं की तुलना में हर जांच के साथ पाया शोफ की मनाया प्रतिदीप्ति संकेतों दोहराते हैं। प्रत्येक भूखंड (5 एन =) SEM के ± का मतलब प्रतिदीप्ति संकेतों का प्रतिनिधित्व करता है। रेखांकन के साथ, हर जांच के साथ पाया शोफ की अधिकतम प्रतिदीप्ति संकेत (; लिप-dQ 2-4 घंटा और मुफ्त वाई-676-COOH, 2 घंटा पद इंजेक्शन लिप-क्यू, 8 घंटा) आसानी से विख्यात है। वहाँ टी में लिप-dQ बनाम लिप-क्यू = 0-24 मानव संसाधन के साथ शोफ के एक काफी (पी = 0.001) उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता है, और टी पर मुफ्त वाई-676-COOH बनाम लिप-क्यू = 4-24 मानव संसाधन के साथ। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5 चित्रा 5: चूहों 24 घंटे बाद जांच के आवेदन से अंगों के जैव ऑप्टिकल पूर्व vivo छवियों, और अंगों के प्रतिदीप्ति तीव्रता के इसी अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण। प्रत्येक बार प्रतिदीप्ति तीव्रता का मतलब का प्रतिनिधित्व करता है (एन = 4) SEM के ±। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Liposome सूत्रीकरण आकार [एनएम] Polydispersity सूचकांक (पीआई) जीटा संभावित [एम वी]
लिप-dQ (dequenched) 123.4 ± 0.6 0.055 ± 0.02 -10.6 ± 0.4
लिप-क्यू (बुझती) 118.5 ± 0.7 0.04 ± 0.02 -9 ± 2
लिप-NBD (डब्ल्यू / उप-676-COOH ओ) 123.0 ± 1.4 0.04 ± 0.03 -11 ± 1

तालिका 1: गतिशील प्रकाश बिखरने से liposomes की विशेषता।

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Discussion

Liposomes भी फ्लोरोसेंट रंगों के लिए वितरण प्रणाली के रूप में काम कर सकते हैं, वे लक्ष्य रोगों की इमेजिंग कर सकें। ऐसे NIRF डाई, यहां इस्तेमाल DY676-COOH, के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों की उच्च सांद्रता के encapsulation फँस डाई की प्रतिदीप्ति शमन के एक उच्च स्तर की ओर जाता है। प्रतिदीप्ति शमन, उच्च एकाग्रता में कई fluorophores के साथ देखा एक घटना लक्षित क्षेत्र के एक उच्च संवेदनशीलता और विश्वसनीय का पता लगाने की मांग की है, जहां vivo इमेजिंग अनुप्रयोगों में कई में शोषण किया जा सकता है। liposomes का उपयोग भी इन विवो अनुप्रयोगों के लिए अपरिहार्य है जो डाई की सुरक्षा प्रदान करता है।

फिल्म जलयोजन और बाहर निकालना तकनीक की जरूरत के आधार पर अलग-अलग आकार पर्वतमाला के साथ liposomes की सफल तैयारी में सक्षम बनाता है जो एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है, और इस तरह के विभिन्न पदार्थों 25 के एक भीड़ के encapsulation के रूप में संशोधनों परमिट। इस प्रकार, यह होंठ की तैयारी के लिए उपयुक्त हैosomes इमेजिंग प्रयोजनों के लिए NIR फ्लोरोसेंट रंजक, डी वाई-676-COOH के साथ समझाया। विधि डाई की बुझती एकाग्रता के भीतर हैं, जो 600-840 माइक्रोन intravesicular डाई सांद्रता के साथ liposomes पैदावार। अनायास गठन पुटिका फैलाव के homogenization के लिए इस्तेमाल किया LiposoFast-बुनियादी हाथ extruder के 1 मिलीलीटर मात्रा अप करने के लिए सीरिंज के साथ, वजह डिवाइस की अनुकूलता के लिए, छोटे प्रयोगशाला पैमाने में liposome तैयारी के लिए उपयुक्त है। बड़े पैमाने पर तैयारी के लिए प्रति घंटे 1,000 एल की क्षमता के साथ पुटिका dispersions के homogenize करने में सक्षम हैं जो बड़े उच्च दबाव homogenizers के उपयोग की सिफारिश की है। जेल निस्पंदन (आकार अपवर्जन) क्रोमैटोग्राफी गैर समझाया (मुक्त) डाई अणु 26 से समझाया लिपोसोमल डाई की जुदाई सुनिश्चित करता है जो एक महत्वपूर्ण कदम है। जेल निस्पंदन स्तंभ की लंबाई मुक्त डाई से liposomes के कुशल जुदाई के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, यह कम से कम 28 सेमी लंबाई टी के एक स्तंभ तैयार करने के लिए आवश्यक हैओ सफलतापूर्वक यहां इस्तेमाल नि: शुल्क वाई-676-COOH से liposomes अलग। दिलचस्प बात यह है कि इस लंबाई के रूप में लंबे समय है कि मुक्त Carboxyfluorescein से Carboxyfluorescein (सीएफ) लोड liposomes शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में दो गुना है। जेल निस्पंदन की बड़ी खामी शुद्ध नमूनों की एक 5-6 गुना कमजोर पड़ने है। अत्यधिक ध्यान केंद्रित liposomes की जरूरत है अगर यह ultracentrifugation द्वारा मुआवजा दिया जा सकता है। Ultracentrifugation दौरान liposomes तलछट और सतह पर तैरनेवाला आसानी से 27 से हटाया जा सकता है। ऐसे डायलिसिस 28 के रूप में liposomes ध्यान केंद्रित करने के लिए अन्य तरीकों से अधिक समय ultracentrifugation से लेने वाली हैं।

फिल्म जलयोजन और बाहर निकालना विधि के अलावा, उलट चरण वाष्पीकरण विधि 23 के साथ ही इथेनॉल इंजेक्शन विधि 24 कई हाइड्रोफिलिक पदार्थों के लिए उच्च encapsulation के दक्षता के साथ liposome तैयारी कर सकें। हालांकि, हमारी जांच फ्रीज और पिघलना चक्र के साथ संयुक्त फिल्म जलयोजन का पता चलाएस डी वाई-676-COOH की पर्याप्त intraliposomal encapsulation के लिए सबसे उपयुक्त तरीका हो। फिल्म जलयोजन के लिए इस्तेमाल शुरू डी वाई-676-COOH एकाग्रता बढ़ाने प्रभावकारिता और 30 मिमी की एक निश्चित लिपिड एकाग्रता प्रयोग किया जाता है जब intraliposomal डाई, की एकाग्रता बढ़ जाती है। फ्रीज और पिघलना विधि के साथ इस encapsulation के प्रभावकारिता के बावजूद इस्तेमाल किया शुरू करने डाई एकाग्रता के 10% से कम है, लेकिन फिर भी इमेजिंग के लिए आवश्यक शमन एकाग्रता की encapsulation के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा, जेल निस्पंदन द्वारा liposomes से अलग मुक्त डाई desalting और निर्जलीकरण निर्माता के निर्देशों के अनुसार, संभव है और एक समग्र न्यूनतम डाई नुकसान पुनः encapsulation के बनाने के द्वारा साफ किया जा सकता है। polydispersity सूचकांक और लिप-क्यू के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ द्वारा देखा के रूप में अंतर्निहित प्रोटोकॉल द्वारा डाई के encapsulation आकार और liposomes की आकृति विज्ञान पर कोई प्रभाव है।

कई आसान तरीके evaluat करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैई तैयार फ्लोरोसेंट liposomes.DY-676-COOH की गतिविधि शायद एच-डिमर गठन और डाई अणुओं के बीच पीआई-स्टैकिंग बातचीत से उत्पन्न उच्च सांद्रता 21,29 पर आत्म-बुझाने के लिए एक उच्च प्रवृत्ति है। उच्च सांद्रता में डाई अणु की फोर्स्टर radii की निकटता की वजह से होते हैं जो इन मुलाकातों, कमजोर पड़ने 30 से विलोपित किया जा सकता है। इसलिए, डी वाई-676-COOH की उच्च सांद्रता के encapsulation केवल जिससे इसकी उच्च एकाग्रता बनाए रखने और, एक नीली स्थानांतरित कर दिया अवशोषण के रूप में पहचान की जा सकती है जो प्रतिदीप्ति शमन को बनाए रखना है, vivo में, बल्कि आसपास के बफर से opsonization से डाई की रक्षा नहीं करता शिखर और चित्रा 2 में देखा के रूप में कम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन। -80 डिग्री सेल्सियस पर धीरे-धीरे liposomes बर्फ़ीली उतावली 30 डिग्री सेल्सियस पर thawed जब लिपोसोमल झिल्ली को नुकसान का कारण बनता है, जो जलीय इंटीरियर 31 के भीतर बर्फ क्रिस्टल के गठन की ओर जाता है। रिहाई, कमजोर पड़ने और प्रतिदीप्ति actiलिप-क्यू इस प्रकार के एक उच्च, शमन एकाग्रता sequesters इंगित करता है कि जो एक एकल अवशोषण शिखर में पता चला है ठंड के बाद बफर में इंट्रा-लिपोसोमल डी वाई-676-COOH के छुपा और प्रतिदीप्ति तीव्रता में लगभग 2.5 गुना वृद्धि (चित्रा 2), डी वाई-676-COOH और सक्रिय है। वे दोनों कई फ्लोरोसेंट रंगों 32 के वर्णक्रमीय गुणों को प्रभावित के बाद से अन्य तरीकों, जैसे मुक्त डाई और लिपोसोमल समझाया डाई के बीच स्पष्ट मतभेद प्रकट नहीं करते डिटर्जेंट या कार्बनिक सॉल्वैंट्स के उपयोग के रूप लिपोसोमल लिपिड bilayer को नुकसान करने के लिए। धीमी गति से ठंड और इसलिए यहां बताया कठोर विगलन विधि liposomes में fluorophores के उच्च encapsulation और एक फलस्वरूप प्रतिदीप्ति शमन मान्य करने के लिए एक और अधिक विश्वसनीय और होनहार पद्धति के रूप में कार्य करता है। बरकरार लिप-क्यू (चित्रा 2) के अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा से, अवशिष्ट प्रतिदीप्ति के कुछ स्तर का पता लगाया जा सकता है। इस लाइपो भीतर गैर-बुझती डाई मोनोमर्स से परिणाम कर सकते हैंSomes और भी electrostatic बातचीत और फॉस्फोलिपिड ध्रुवीय सिर समूहों में 33 से समझाया डाई के प्रभाव से।

चित्रा 3 में देखा जा सकता है, अत्यधिक phagocytic murine मैक्रोफेज और हल्के phagocytic मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन में लिप-क्यू के एक विशिष्ट संचय, यू-118MG 34, नहीं, बल्कि गैर-phagocytic मानव fibrosarcoma सेल लाइन एचटी-1080 में, इंगित करता है फ़ैगोसाइट सूजन प्रक्रियाओं के प्रमुख खिलाड़ी रहे हैं कि जब से सूजन का लिप-क्यू आधारित इमेजिंग, अनुकूल होगा। ऊर्जा की कमी मुक्त वाई-676-COOH के तेज नहीं लिप-क्यू के तेज को समाप्त करता है, लेकिन तथ्य यह है कि लिप-क्यू की phagocytic तेज की विशिष्टता substantiates और लिप-क्यू, प्रयोग के दौरान बरकरार पता चलता है कि डाई के किसी और रिहाई और ऊर्जा स्वतंत्र तेज पता लगाने प्रतिदीप्ति प्रमुख जगह ले जाएगा। हरी फ्लोरोसेंट फॉस्फोलिपिड Embedding, Liposome bilayer में NBD डोप सूक्ष्म इमेजिंग और discriminatio सक्षम बनाता हैएन के बीच पहले 32 के रूप में रिपोर्ट समय पर निर्भर तेज प्रयोगों में किया जाता है, खासकर अगर सेलुलर अपमानित liposomes से गैर अपमानित। सूक्ष्म छवियों 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के बाद अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण द्वारा निर्धारित रूप में, सेल छर्रों का प्रतिदीप्ति तीव्रता के स्तर के साथ संबद्ध है, जो डी वाई-676-COOH की NIR के प्रतिदीप्ति प्रकट करते हैं। मानव ग्लियोब्लास्टोमा डी वाई-676-COOH और पूर्व की तुलना में NBD डोप दोनों के निचले प्रतिदीप्ति पता चलता है, जबकि इस के अनुसार, murine मैक्रोफेज सेल लाइनों, उच्चतम प्रतिदीप्ति दिखा। मानव fibrosarcoma सेल लाइन जैसी कि उम्मीद थी, एचटी-1080 लिपोसोमल रंजक या लिप-क्यू तेज, phagocytosis द्वारा मुख्य रूप से तथ्य यह है कि मजबूत, जो नि: शुल्क वाई-676-COOH, या तो कोई प्रतिदीप्ति प्रकट करते हैं।

की क्षमता की जाँच करने के लिए phagocytosis संचालित सूजन के vivo इमेजिंग में, कई नियंत्रण पर विचार किया गया लिप-क्यू-आधारित है। नि: शुल्क वाई-676-COOH phagocyt द्वारा उठाया जा सकता है कि ध्यान में रखते हुएOsis, लिप-क्यू के opsonization phagocytes द्वारा लिया जा सकता है जो डाई की रिहाई के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इससे बचने के लिए, लिप-क्यू 5 मोल% PEGylation के साथ तैयार किया गया था। इसके अलावा, यह कारण सूजन आधारित EPR प्रभाव और सक्रिय तेज और प्रतिदीप्ति सक्रियण के लिए तेज के बीच भेद करने के लिए आवश्यक है। यह पता करने के लिए, मूल्यांकन और zymosan प्रेरित शोफ असर चूहों में तीन अलग-अलग जांच, अर्थात् हमेशा पर, लिप-dQ, बुझती लिप-क्यू और मुफ्त वाई-676-COOH की तुलना जरूरी हो गया था। Saccharomyces cerevisiae और Candida albicans के सेल दीवारों से तैयार किया जाता है जो Zymosan-ए dectin-एक और टोल की तरह रिसेप्टर 2/6 (TLR 2/6) के माध्यम से साइटोकाइन स्राव का एक प्राकृतिक उत्तेजक है। बदले में स्रावित साइटोकिन्स जिससे एक प्लीहा जलाशय 35 के साथ ही न्यूट्रोफिल, और सूजन साइटों के लिए उनके प्रवास से monocytes / मैक्रोफेज की intravasation / परिस्त्राव सहजता, संवहनी लीकेज में जो परिणाम बहाव के Cascades की सक्रियता को प्रेरित(शोफ) 36-39। zymosan आधारित monocytes / मैक्रोफेज परिस्त्राव और माइग्रेशन प्रक्रिया zymosan सूजन प्रक्रियाओं 36-39 के अध्ययन के लिए एक सामरिक उपकरण बना देता है, जो केवल 4.5-6 घंटा की जरूरत है। कारण सूजन के दौरान होने वाली नाड़ी लीकेज को, नसों के द्वारा जांच या तो सूजन साइट या extravasate करने के लिए अपने प्रवास के दौरान monocytes / मैक्रोफेज (phagocytes) द्वारा लिया जा सकता है और शोफ साइट (EPR प्रभाव) 40 पर ले जाया जा इंजेक्शन। गैर-बुझती लिप-dQ का उपयोग लिप-क्यू से शोफ संकेतों के लिए एक समग्र मजबूत पृष्ठभूमि, और monocytes और मैक्रोफेज के पलायन को दर्शाता है जो सूजन के एक प्रतिदीप्ति वृद्धि का पता चलता है। प्रभाव में, शोफ की अधिकतम प्रतिदीप्ति पहले से ही लिप-dQ के 2-4 घंटे बाद आवेदन को देखा है और 8 घण्टे तक लगभग स्थिर बनी हुई है। लिप-dQ और लिप-क्यू करने का विरोध किया है, मुफ्त वाई-676-COOH के इंजेक्शन के बाद तेजी से छिड़काव से होकर गुजरती है और शोफ के विशिष्ट इमेजिंग संभव नहीं है, इसलिए है कि 4 घंटे के भीतर मंजूरी दे दी है। मेंterestingly, शोफ के प्रतिदीप्ति तीव्रता और बहुत कम पृष्ठभूमि संकेतों में लगातार वृद्धि में लिप-क्यू परिणामों का उपयोग करें। लिप-क्यू के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता में यह लगातार वृद्धि लिपोसोमल जारी की डाई के सक्रियण प्रतिदीप्ति को जिम्मेदार ठहराया है। साथ में ले ली, यह लिप-dQ चार घंटे बाद इंजेक्शन पर अधिकतम प्रतिदीप्ति (EPR प्रभाव और monocyte माइग्रेशन) से पता चलता है के बाद से लिप-क्यू आधारित इमेजिंग में EPR प्रभाव का योगदान बहुत कम है कि यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है। इस प्रकार, लिपोसोमल encapsulation के संरक्षण और बदले में विशेष रूप से phagocytic कोशिकाओं द्वारा internalization और गिरावट (प्रतिदीप्ति सक्रियण) के बाद, शोफ के vivo इमेजिंग में एक और अधिक विश्वसनीय सक्षम बनाता है जो उप-676-COOH, के विशिष्ट वितरण प्रदान करता है। अब तक, फ्लोरोसेंट liposomes की इमेजिंग गुणों को मान्य करने के zymosan प्रेरित हिंद पैर शोफ का उपयोग नया है। इस के साथ साथ सूचना दी प्रोटोकॉल अलग फ्लोरोसेंट रंगों के encapsulation से और अलग अलग निरोधात्मक DRU के प्रभाव इमेजिंग द्वारा दोनों का विस्तार किया जा सकता हैसूजन के शामिल होने पर जी एस, और इसलिए तैयारी और बायोमेडिकल इमेजिंग के लिए उपयुक्त जांच के लक्षण वर्णन के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

उपयुक्त इमेजिंग जांच को परिभाषित करने की दिशा में एक और महत्वपूर्ण कदम उनके औषधीय गुणों और उन्मूलन मार्गों का सत्यापन है। इस तरह इन अंगों से जिगर और गुर्दे के साथ-साथ उनके छोटे प्रतिधारण और उपयुक्त उन्मूलन के रूप में उत्सर्जन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जो अंगों में जांच के वितरण की जांच के ज्यादा होने की संभावना मरीज पर कोई प्रतिकूल प्रभाव दिखा देंगे कि, आम तौर पर एक संकेत है। इस के अनुसार, चूहों के अंगों के माध्यम से लिपोसोमल फ्लोरोफोरे की एक पसंदीदा उन्मूलन का प्रतीक है जो लिप-क्यू या मुफ्त वाई-676-COOH पता चलता है केवल हल्के जिगर / पित्ताशय की प्रतिदीप्ति और गुर्दे, के 24 घंटे बाद इंजेक्शन तैयार Hepatobiliary मार्ग। इन अंगों में जांच और उनके कुशल उन्मूलन की कमी आवास 7 fol के द्वारा की हैअंगों के विकास को उच्च प्रतिदीप्ति संकेतों लिप-क्यू या मुफ्त वाई-676-COOH के 32 में से 6 घंटा पद इंजेक्शन तैयार किया। इन टिप्पणियों liposomes 41 के उन्मूलन के अनुसार कर रहे हैं और जांच निस्र्पक जब biodistribution पढ़ाई सहित के महत्व को पीठ। इस तरह के सक्रियण 42,43 के पूरक हैं और त्वचा irritations के रूप में प्रतिकूल दुष्प्रभाव, नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया लिपोसोमल योगों के लिए सूचित किया गया है हालांकि, इस तरह के प्रभाव अंतर्निहित liposomes साथ नहीं पाया गया। इसके अलावा, चूहों अंगों से जांच की निकासी को पूरा करने के लिए नेतृत्व की जांच के इंजेक्शन के बाद दो सप्ताह के लिए प्रतिरक्षा कमी चूहों का अवलोकन () नहीं दिखाया।

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Acknowledgments

इस काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft हाई-698 / 10-1 अनुदान और आरयू 1652 / 1-1 के द्वारा समर्थित किया गया था। हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और उनकी तरह की सहायता के लिए कंपनी DYOMICS जीएमबीएच, जेना के लिए डोरीन मई धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine Avanti Polar Lipids 840051P Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol Sigma C8667 Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 880120P Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) Avanti Polar Lipids 810145P Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) Sartorius AG Research RC 210 P used for weighing the phospholipids
Rotavapor Büchi Labortechnik AG R-114 used for hydration of phospholipid film
Waterbath Büchi Labortechnik AG R-481 used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller Büchi Labortechnik AG B-720 used for hydration of phospholipid film
Vacobox Büchi Labortechnik AG B-177 used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller LAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		 WKL 230 used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH Dyomics GmbH 676-00 Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan Applichem A1086 buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan Carl Roth GmbH + Co. KG Y015.2 used for liposome preparation
Sonicator Merck Eurolab GmbH USR 170 H used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) Scientific Industries Inc. SI-0256 used for liposome preparation
Sephadex G25 medium  GE Healthcare Europe GmbH 17-0033-01 used for liposome purification
Triton X100 Ferak Berlin GmbH 505002 used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic Avestin Inc. used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) VWR used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima BMG Labtech used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS Malvern used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge  Beckmann Coulter GmbH XL 80 used for concentration of the samples
Rotor Beckmann Coulter GmbH SW 55 TI used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae Sigma Z4250-250MG used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9%) Fresenius GmbH PZN-2159621 used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer Ohmeda Isotec 4 used for anesthesizing animals
Isoflurane Actavis GmbH  PZN-7253744 anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W Lucky Reptile 61202-HTP-20 used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)  Braun PZN-3115465 used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream Jenapharm PZN-3524531 used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution PAA Laboratories /Biochrom AG L2045 w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides BD Biosciences 354108 used for cell culture followed by microscopy 
Cell culture flasks Greiner BioOne
Cell culture media Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum  Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) Sigma P4832 used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor ThermoScientific  S21022-3 Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258 AppliChem DNA stain for microscopy
Hera-Safe Heraeus Instruments sterile work bench used for cell culture
HERA cell Heraeus Instruments Incubator used for cell culture
LSM510-Meta Zeiss used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system CRi, Woburn used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) GE Healthcare used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) Jasco used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male) Elevage Janvier, France used for inflammation trials

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References

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Tansi, F. L., Rüger, R., Rabenhold, M., Steiniger, F., Fahr, A., Hilger, I. Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52136, doi:10.3791/52136 (2015).

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