Påvisning af<em> In Situ</em> Protein-protein-komplekser på<em> Drosophila</em> Larve Neuromuskulær Junction Brug Proximity ligeringsassayet

Summary

Denne protokol viser, hvordan Proximity ligeringsassayet kan anvendes til at påvise in situ protein-protein interaktioner på Drosophila larver neuromuskulære junction. Med denne teknik, er Diske store og Hu-li tai Shao vist at danne et kompleks på den postsynaptiske region, en forening tidligere identificeret gennem samarbejde immunoudfældning.

Abstract

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.

Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Introduction

Drosophila Discs store (Dlg) er et konserveret medlem af membran-associeret guanylat kinase familien af stilladser proteiner, der hjælper organisere samlingen af store proteinkomplekser på specifikke steder af plasmamembranen. Oprindeligt identificeret som en tumor suppressor protein DLG tjener som en vigtig faktor for epitelial apicobasal polaritet ^1,2,3. DLG fungerer også som en vigtig stillads modul ved den neuromuskulære forbindelse (NMJ) af glutamaterge motoriske neuroner i larveudvikling ^4. DLG spiller forskellige roller på den larve NMJ, og dens pleiotropism afhængig af sin evne til at associere med flere proteiner ^5,6. Et sådant protein er Hu-li tai Shao (HTS), en homolog til de mammale adducins, der hovedsageligt er beskrevet i forhold til deres roller i regulering af actin-spektrin cytoskeleton ^7. Det er tidligere blevet vist, at DLG og Hts kan danne et kompleks med hinanden baseret på in vitro </em> co-immunopræcipitationsforsøg involverer hele voksne flyve lysater ^8. En mangel af disse resultater, er imidlertid, at de ikke angiver, hvor det komplekse former. Med brug af immunhistokemi er fordelingerne af DLG og Hts observeret at overlappe på den postsynaptiske membran af larver NMJs, men er de i et kompleks i denne region ^8? Som nylig vist og beskrevet yderligere her er Proximity ligeringsassayet (PLA), der anvendes til at lede efter en in situ association mellem DLG og Hts specifikt på larver NMJ ^27.

PLA er en relativt ny teknik, der anvendes for det meste i celle- og vævskultur, der kan detektere protein-protein-interaktioner in situ ^9. I dette assay er primære antistoffer mod de to proteiner af interesse detekteres med et par artsspecifikke sekundære antistoffer, betegnet PLA sonder, der er konjugeret til oligonukleotider (figur 1A, B). Hvis to proteins er i tæt nærhed af hinanden (dvs. inden for et par snese nanometer), afstanden mellem de vedlagte PLA prober kan bro gennem hybridisering af to yderligere stik oligonukleotider (figur 1c). I denne konformation, de frie ender af forbindelsesdelene oligonukleotider er tæt nok til at komme i kontakt med hinanden, og en lukket cirkulært DNA-molekyle kan dannes ved in situ ligering (figur 1D). Den cirkulære DNA-molekyle tjener som en template for in situ rullende cirkel amplifikation, der primes af en af oligonukleotiderne konjugeret til PLA prober (figur 1E). Sekvenser inden den resulterende amplificerede, concatemeric DNA-produkt kan derpå visualiseret med fluorescensmærkede komplementære oligonukleotidprober (figur 1F). Da det amplificerede DNA forbliver fastgjort til en af ​​PLA prober den subcellulære lokalisering af protein-protein-interaktion withina væv kan let bestemmes.

Flere metoder er almindeligt anvendt til at påvise protein-protein interaktioner, herunder in vitro-teknikker, såsom co-immunopræcipitation, pull-down assays og gær to-hybrid screening, og in vivo teknikker, såsom Förster Resonance Energy Transfer (FRET), og bimolekylær Fluorescence Komplementering ( BiFC). En fælde af in vitro-teknikker er, at de ikke identificere, hvor interaktionen endogent forekommende, mens ovennævnte in vivo teknikker involverer den kunstige ekspression af fusionsproteiner, der kan afvige fra det native adfærd af deres endogene modstykker. En stor fordel af PLA er, at det er i stand til at bestemme i et væv den subcellulære lokalisering af endogent protein interaktionskandidater, som er i tæt nærhed af hinanden og sandsynligvis danner et kompleks med graden af ​​nærhed kræves for at generere et signal, der kan sammenlignes med FRET og BiFC. PLA kan detektere interaktioner med høj specificitet og sensitivitet på grund af koblingen af ​​antistof anerkendelse og DNA-amplifikation. Således kan assayet generere diskrete lyse signaler i form af puncta at afsløre den nøjagtige position af interaktionen. Desuden kan næppe synlige antigener påvises. Endelig PLA er en forholdsvis simpel teknik til at udføre, og det tager længere end en standard immunhistokemiske procedure at fuldføre. Derfor PLA giver en teknisk fordel i forhold til andre protein-protein interaktion assays, som ofte plaget med lange tilberedningstider og omfattende fejlfinding.

Denne protokol viser, hvordan PLA kan anvendes til Drosophila larvestadiet NMJ med henblik på detektering af endogene protein-protein-interaktioner in situ. Her er PLA udføres på larver krop væg muskel præparater, hvor DLG og Hts er vist til faktisk eksistere i et kompleks på den postsynaptiske region NMJs. PLA ikke tidligere er blevet anvendt til at undersøge larve NMJ, og der er på nuværende tidspunkt kun en håndfuld af offentliggjorte papirer, der har brugt denne analyse i Drosophila væv. Det er håbet, at yderligere eksponering af PLA til Drosophila samfund vil resultere i øget anvendelse som et supplerende redskab til at supplere andre, mere almindeligt anvendte protein-protein interaktion assays.

Protocol

1. Krop Wall Forberedelse BEMÆRK: Forberedelse af tredje stadie larver krop vægge (til undersøgelse af de NMJs der innerverer kropsvæggen muskler) blev udført som tidligere beskrevet i Brent et al 10, eller Ramachandran og Budnik 11,12, men med nogle ændringer.. Dissektion Hæv flyve lagre og kors ved 25 ° C i fem til seks dage under anvendelse af standard procedurer 13. Pick kravlende tredje stadie larve…

Representative Results

I vildtype tredje stadie larver NMJs er Dlg overvejende findes på den postsynaptiske membran af type I glutamaterge boutons, med DLG immunoreaktivitet niveauer bliver mere udtalt i type IB boutons end typen Er boutons (figur 3A) 4. Hts er til stede i hele musklen, men koncentrerer på den postsynaptiske region med Hts immunoreaktivitet niveauer vises ens i både type I boutons, og findes også præsynaptisk (figur 3A) 8,17. Bemærk, at fordelingerne af DLG og Hts …

Discussion

Denne rapport viser, hvordan PLA kan anvendes på Drosophila larvernes NMJ. Assayet udføres på larvestadiet Kropsvæggen muskel præparater med henblik på påvisning af endogene protein-protein interaktioner stede på NMJ. Med denne teknik er DLG og Hts vist at være i tæt nærhed af hinanden, og således findes i et kompleks, specielt på den postsynaptiske region ^27. Til støtte for dette resultat, har en tidligere undersøgelse dokumenteret, at de sammen med følgende data: 1) de immunoreaktiv…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Forceps (fine #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)	Fine Science Tools	26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine)	Fine Science Tools	15200-00
Platform Slides			Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20mm gap in between for sample mounting.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories – 8180-1), Na2HPO4 (Caledon – 8120-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Bouin's Solution	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS			PFA (Anachemia Science – 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich – T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT			BSA (Bioshop Canada – ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)			Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4D4	Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)	Jackson              ImmunoResearch	123-065-021	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat	Jackson             ImmunoResearch	705-095-003	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific – BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040