Microscopia a forza atomica di Red-Light Fotorecettori Uso della mappatura PeakForce Quantitative nanomeccanico Proprietà
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
Microscopia a forza atomica (AFM) utilizza una punta piramidale collegata ad un cantilever per sondare la risposta forza di una superficie. Le deviazioni di punta possono essere misurati a ~ 10 pN da un laser e rivelatore sectored, che può essere convertito in immagine topografia. Modulazione di ampiezza o AFM "tapping mode" comporta la sonda il contatto intermittente con superficie mentre oscilla alla sua frequenza di risonanza per produrre un'immagine. Utilizzato in combinazione con una cella di fluido, toccando modalità AFM permette l'imaging di macromolecole biologiche come le proteine in condizioni fisiologicamente rilevanti. Toccando modalità AFM richiede la sintonizzazione manuale della sonda e frequenti aggiustamenti di una moltitudine di parametri di scansione, che può essere difficile per gli utenti inesperti. Per ottenere immagini di alta qualità, queste regolazioni sono il momento più consumo.
PeakForce quantitativa nanomeccanico Property Mapping (PF-QNM) produce un'immagine misurando un respon forzacurva se per ogni punto di contatto con il campione. Con il software ScanAsyst, PF-QNM può essere automatizzato. Questo software consente di regolare il set-point, frequenza di azionamento, velocità di scansione, i guadagni, e altri importanti parametri di scansione automatica per un dato campione. Non solo questo processo proteggere entrambe le sonde fragili e campioni, riduce significativamente il tempo richiesto per ottenere immagini ad alta risoluzione. PF-QNM è compatibile per l'imaging AFM in liquido; Pertanto, esso ha una vasta applicazione per l'imaging di materiali biologicamente rilevanti.
Il metodo presentato in questo articolo descrive l'applicazione del PF-QNM per ottenere immagini di un fotorecettore batterica a luci rosse, RpBphP3 (P3), da fotosintetico R. palustris nel suo stato-luminosa adatta. Usando questo metodo, i singoli dimeri proteici di P3 e aggregati di dimeri sono stati osservati su una superficie mica in presenza di un buffer di imaging. Con opportuni adeguamenti per superficie e / o concentrazione della soluzione, questo metodopuò essere generalmente applicato ad altre macromolecole biologicamente rilevanti e materiali morbidi.
Introduction
Microscopia a forza atomica (AFM) è diventato uno strumento molto importante per indagare le proprietà strutturali e meccaniche delle superfici, film sottili, e le singole molecole dalla sua invenzione nel 1986 (Figura 1). 1-3 Utilizzo di una cella liquido, il metodo ha diventa particolarmente utile negli studi di macromolecole biologiche e cellule anche che vivono in un ambiente fisiologicamente rilevanti. 4-10 Toccando modalità AFM è stato tradizionalmente usato per l'imaging materiali morbidi o molecole debolmente legate alla superficie, poiché il contatto-mode AFM è in genere inadatto dovuto per i danni causati dalle forze laterali esercitate sul campione dal cantilever. 11 Tapping modalità AFM riduce sostanzialmente queste forze avendo la punta intermittenza toccare la superficie piuttosto che essere in costante contatto. In questa modalità, il cantilever è oscillato in corrispondenza o in prossimità della sua frequenza di risonanza normale alla superficie. Allo stesso modo di contattare modalità AFM, topografia è analeyzed tracciando il movimento dello z-piezo come funzione di xy (distanza).
La dinamica a sbalzo possono essere molto instabili o in prossimità di risonanza; Pertanto, essi sono molto impegnativo per automatizzare al di fuori di una situazione di "steady-state". In particolare, queste dinamiche dipendono sia dalle proprietà del campione e ambiente di scansione. Per una molecola adsorbita morbida per un (er) superficie dura, un ciclo di feedback ben sintonizzato per la molecola può portare a risposte di oscillazione per la superficie. Operazione nel liquido complica ulteriormente la messa a punto del cantilever. Le variazioni di livelli di temperatura o fluidi richiedono costante adeguamento del set point, guadagni, e altri parametri di imaging. Queste regolazioni tendono ad essere molto in termini di tempo e stimolante per gli utenti.
Peak Forza quantitativa nanomeccanico Property Mapping (PF-QNM), come tapping mode AFM, evita interazioni laterali dal intermittenza contattando il campione (Figura 2). 12-15 </ Sup> Tuttavia, PF-QNM funziona in modalità non-risonante e frequenze molto più basse rispetto toccando modalità AFM. Questo elimina i problemi di sintonia di maschiatura modalità AFM, in particolare quelli aggravato dalla presenza di fluido. Con PF-QNM, le immagini sono raccolte prendendo una curva di risposta forza in ogni punto di contatto. Con l'aggiunta di software ScanAsyst, 15 regolazione dei parametri di scansione può essere automatizzato e un'immagine ad alta risoluzione ottenuta in pochi minuti anche gli utenti inesperti. Una volta che l'utente diventa più familiarità con l'AFM, uno o tutti i parametri automatizzati potrebbero essere disattivate in qualsiasi momento, che permette di sperimentalista per ottimizzare la qualità dell'immagine manualmente. Fin dalla sua istituzione, PF-QNM è stato applicato per mappare batteriorodopsina, una proteina di membrana, e di altre proteine native a livello submolecolare. 16-18 Per batteriorodopsina, c'è una correlazione diretta tra flessibilità proteine e raggi X delle strutture cristallografiche. PF 12 -qnM è stato utilizzato per studiare le cellule viventi con alta risoluzione. 19,20 connessioni importanti, inoltre, i dati PF-QNM ha chiariti tra struttura e la meccanica all'interno della membrana eritrocitaria che sono critici per l'integrità e la funzione delle cellule. 21
Abbiamo impiegato microscopia a scansione di sonda (SPM) metodi, tra cui 22 AFM, 23 per studiare la struttura dei fotorecettori a luci rosse chiamato bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Sono costituiti da un modulo di rilevamento della luce covalentemente legato ad un modulo di segnalazione-effector tale come istidina chinasi (HK). 26 Il modulo luce di rilevamento contiene tipicamente un cromoforo bilin che subisce una trasformazione strutturale su assorbimento di un fotone, con una serie di modifiche strutturali che raggiungono il modulo di segnalazione-effettore e portano ad una trasformazione globale della proteina intera . 24,27-29 Sulla base di questa trasformazione, ci sono due distinti assorbente la luce stati di BphPs, una luce che assorbe stato rosso e rosso lontano, indicati come Pr e Pfr. Pr è termicamente stabile, stato adattato al buio per la maggior parte BphPs. 28 Le basi molecolari della Pr / Pfr fotoconversione non è del tutto compreso a causa della limitata conoscenza strutturale di queste proteine. Con l'eccezione di una struttura da D. radiodurans, 30 tutti pubblicati a raggi X delle strutture cristallografiche di queste proteine sono in stato adattato all'oscurità e mancano dominio effettore. I BphPs intatti sono troppo grandi per essere efficacemente studiato da Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) e sono notoriamente difficili da cristallizzare nella loro forma intatta (in particolare nello stato di luce-adattato) per la cristallografia a raggi X. BphPs Recentemente sono stati progettati come marcatori proteici fluorescenti infrarossi (di IFP). 31 Caratterizzazione strutturale di queste proteine può ulteriori aiuti in efficace progettazione IFP. 32-36
Il focus di questo articolo è quello di presentare una procedura perimaging BphPs utilizzando AFM liquido-cell tramite PF-QNM. Il metodo è dimostrato da studi dello stato luce-adattata del RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) dal batterio fotosintetico R. palustris. La procedura di AFM qui presentata è l'approccio pratico e diretto per l'imaging di proteine e altre macromolecole biologiche. Con questo metodo, i dettagli strutturali di singole molecole possono essere raccolti in un breve periodo di tempo, simile ad un corso di scienze sessione di laboratorio di livello superiore. Attraverso la misurazione sezioni e completando ulteriori analisi dimensionali, i dati sperimentali possono essere paragonati a modelli computazionali utili. 37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM è una scansione di sonda metodo di microscopia pienamente in grado di immaginare proteine e altre macromolecole biologiche in condizioni fisiologicamente rilevanti. In confronto a cristallografia a raggi X e NMR, una limitazione di AFM è la sua incapacità di raggiungere la stessa risoluzione, risoluzione particolarmente laterale. Quando si utilizza AFM per analizzare una molecola su qualsiasi superficie, l'impatto della superficie e la sonda sull'immagine della molecola devono essere considerati anc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il programma NSF-MRI (CHE: 1.229.103) è riconosciuto per finanziare l'acquisto di nuovi elettronica di controllo, software, cellule, liquidi e altre attrezzature necessarie per assemblare un doppio AFM / STM. Riconosciamo i servizi in comune presso l'Università di Chicago programma NSF-MRSEC (DMR-0.820.054) per l'assistenza con AFM strumentazione, formazione, e di imaging, e per il tempo dello strumento messo a disposizione da parte del Materials Research Facilities Network (DMR-0.820.054). Siamo particolarmente Ringraziamo il Dr. Qiti Guo, il dottor Justin Jureller, e il Prof. Ka Yee Lee per accogliere i nostri studenti prima il finanziamento della proposta di NSF-risonanza magnetica che ha portato la strumentazione necessaria per il nostro campus. Riconosciamo il finanziamento di una borsa del titolo III dello stelo (ID: P031C110157) assegnato a Northeastern Illinois University che ha fornito borse di ricerca estivi per studenti e docenti, nonché il supporto per materiali di consumo. Infine, riconosciamo Bruker-Nano, Inc. per il continuo supporto strumentale e per il permesso di reproduce un grafico che mostra il meccanismo di PeakForce QNM e ad usare la parola ScanAsyst per descrivere il software automatizzato.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- . The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , .
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
