PeakForce मात्रात्मक Nanomechanical गुण मैपिंग का उपयोग रेड लाइट photoreceptors की परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) एक सतह के बल प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक ब्रैकट से जुड़ी एक पिरामिड टिप का उपयोग करता है. टिप की deflections छवि स्थलाकृति में बदला जा सकता है जो एक लेजर और सेक्टर डिटेक्टर, द्वारा करने के लिए ~ 10 पी.एन. मापा जा सकता है. आयाम मॉड्यूलन या "दोहन मोड" AFM एक छवि का निर्माण करने के लिए अपने गुंजयमान आवृत्ति पर oscillating जबकि सतह के साथ आंतरायिक संपर्क बनाने जांच शामिल है. एक द्रव सेल के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, दोहन मोड AFM ऐसे physiologically प्रासंगिक परिस्थितियों में प्रोटीन के रूप में जैविक अणुओं की इमेजिंग सक्षम बनाता है. दोहन मोड AFM जांच और अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है जो स्कैनिंग मापदंडों के एक भीड़ के लगातार समायोजन का मार्गदर्शन सुधार आवश्यक है. उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए, इन समायोजन सबसे अधिक समय लगता है.
PeakForce मात्रात्मक Nanomechanical गुण मैपिंग (पीएफ-QNM) एक बल जिम्मेदारी को मापने के द्वारा एक छवि का उत्पादननमूने के साथ संपर्क की हर बात के लिए एसई वक्र. ScanAsyst सॉफ्टवेयर के साथ, पीएफ-QNM स्वचालित किया जा सकता. यह सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से किसी नमूने के लिए सेट सूत्री, ड्राइव आवृत्ति, दर स्कैन, लाभ, और अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर स्कैन समायोजित करता है. इतना ही नहीं इस प्रक्रिया कमजोर जांच और नमूने दोनों की रक्षा करता है, यह काफी उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय कम कर देता है. पीएफ-QNM द्रव में AFM इमेजिंग के लिए संगत है; इसलिए, यह जैविक रूप से प्रासंगिक सामग्री इमेजिंग के लिए व्यापक आवेदन किया है.
इस पत्र में प्रस्तुत विधि संश्लेषक आर से एक जीवाणु लाल बत्ती फोटोरिसेप्टर, RpBphP3 (पी 3) की छवियों को प्राप्त करने के लिए पीएफ-QNM के आवेदन का वर्णन इसके प्रकाश अनुकूलित राज्य में palustris. इस विधि का प्रयोग, व्यक्तिगत प्रोटीन पी 3 के dimers और dimers का समुच्चय एक इमेजिंग बफर की उपस्थिति में एक अभ्रक सतह पर मनाया गया है. उचित सतह समायोजन और / या समाधान एकाग्रता, इस विधि के साथआम तौर पर अन्य जैविक रूप से प्रासंगिक अणुओं और नरम सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) 1986 में अपने आविष्कार (चित्रा 1) के बाद से सतहों, पतली फिल्मों, और एकल अणुओं की संरचनात्मक और यांत्रिक गुणों की जांच के लिए एक बहुत महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. 1-3 एक तरल सेल का प्रयोग, विधि है एक physiologically प्रासंगिक वातावरण में जैविक अणुओं के अध्ययन और भी जीवित कोशिकाओं में विशेष रूप से उपयोगी हो गया है. AFM परंपरागत संपर्क मोड AFM के बाद से, नरम सामग्री या सतह को शिथिल बाध्य अणु इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है 4-10 दोहन मोड के कारण आम तौर पर अनुपयुक्त है पार्श्व बलों की वजह से नुकसान के लिए ब्रैकट द्वारा नमूना पर लगाए गए. 11 दोहन मोड AFM काफी नोक रहकर सतह को छूने होने के बजाय लगातार संपर्क में होने से इन बलों को कम करता है. इस मोड में, ब्रैकट पर या सतह के लिए सामान्य इसकी गुंजयमान आवृत्ति के पास डोलती है. इसी प्रकार AFM मोड संपर्क करने के लिए, स्थलाकृति गुदा हैXY (दूरी) के एक समारोह के रूप में जेड piezo के आंदोलन की साजिश रचने के द्वारा yzed.
ब्रैकट गतिशीलता पर या गूंज के पास काफी अस्थिर हो सकता है; इसलिए, वे एक "स्थिर राज्य" स्थिति के बाहर स्वचालित करने के लिए बहुत चुनौती दे रहे हैं. विशेष रूप से, इन गतिशीलता नमूना गुण और स्कैनिंग पर्यावरण दोनों पर निर्भर करते हैं. एक कठिन (ईआर) सतह पर adsorbed एक नरम अणु, अणु के लिए एक अच्छी तरह से देखते प्रतिक्रिया पाश सतह के लिए प्रतिक्रिया दोलन को जन्म दे सकती है. आगे द्रव में ऑपरेशन ब्रैकट की ट्यूनिंग पेचीदा हो. तापमान या तरल पदार्थ के स्तर में परिवर्तन सेट बिंदु, लाभ, और अन्य इमेजिंग मापदंडों की लगातार पुनः समायोजन की आवश्यकता होती है. ये समायोजन बहुत समय लेने वाली और उपयोगकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो जाते हैं.
पीक सेना मात्रात्मक Nanomechanical गुण मैपिंग (पीएफ-QNM), मोड AFM दोहन की तरह, रहकर नमूना (चित्रा 2) से संपर्क करके पार्श्व बातचीत से बचा जाता है. 12-15 </ Sup> हालांकि, पीएफ-QNM न सुनाई देती मोड और दोहन मोड AFM की तुलना में बहुत कम आवृत्तियों में चल रही है. इस दोहन मोड AFM, तरल पदार्थ की उपस्थिति द्वारा exacerbated विशेष रूप से उन लोगों की ट्यूनिंग चुनौतियों समाप्त. पीएफ-QNM के साथ, छवियों संपर्क के हर बिंदु पर एक बल प्रतिक्रिया वक्र लेने से एकत्र कर रहे हैं. ScanAsyst सॉफ्टवेयर के अलावा के साथ, स्कैनिंग मापदंडों के 15 समायोजन स्वचालित किया जा सकता है और एक उच्च संकल्प छवि भी अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं द्वारा मिनट के एक मामले में प्राप्त की. उपयोगकर्ता AFM से अधिक परिचित हो जाता है एक बार, स्वचालित मापदंडों में से किसी एक या सभी छवि गुणवत्ता मैन्युअल ठीक धुन करने experimentalist परमिट जो किसी भी समय निष्क्रिय किया जा सकता है. अपनी स्थापना के बाद, पीएफ-QNM. Submolecular स्तर पर bacteriorhodopsin, एक झिल्ली प्रोटीन, और अन्य देशी प्रोटीन नक्शा करने के लिए लागू किया गया है bacteriorhodopsin के लिए 16-18, प्रोटीन लचीलापन और एक्सरे crystallographic संरचनाओं के बीच सीधा संबंध है. 12 पीएफ -QNएम उच्च संकल्प के साथ जीवित कोशिकाओं की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है. सेल अखंडता और समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं कि एरिथ्रोसाइट झिल्ली के भीतर की संरचना और यांत्रिकी के बीच 19,20 इसके अलावा, पीएफ-QNM डेटा elucidated किया है महत्वपूर्ण कनेक्शन. 21
हम 22 bacteriophytochromes (BphPs) नामक लाल बत्ती फोटोरिसेप्टर की संरचना का अध्ययन करने के AFM, 23 सहित स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी (एसपीएम) के तरीकों कार्यरत है. 24,25 वे covalently एक संकेतन-प्रेरक मॉड्यूल ऐसे से जुड़ा हुआ एक प्रकाश संवेदन मॉड्यूल से मिलकर बनता है हिस्टडीन kinase (एच) के रूप में. 26 प्रकाश संवेदी मॉड्यूल आमतौर पर संरचनात्मक परिवर्तन संकेतन-प्रेरक मॉड्यूल पहुंचने और पूरे प्रोटीन की एक वैश्विक परिवर्तन के लिए अग्रणी की एक श्रृंखला के साथ, एक फोटान का अवशोषण पर संरचनात्मक परिवर्तन आए जो एक bilin क्रोमोफोर शामिल . इस परिवर्तन के आधार पर 24,27-29, दो अलग प्रकाश को अवशोषित है वहाँBphPs, एक लाल और दूर की लाल बत्ती को अवशोषित राज्य के tates, पीआर और पीएफआर के रूप में चिह्नित. पीआर सबसे BphPs के लिए thermally स्थिर, काले अनुकूलित राज्य है. पीआर / PFR photoconversion के आणविक आधार पूरी तरह कारण इन प्रोटीनों की सीमित संरचनात्मक ज्ञान को समझ नहीं है 28. डी से एक संरचना के अपवाद के साथ radiodurans, ये प्रोटीन के 30 सब प्रकाशित एक्स रे crystallographic संरचनाओं काले अनुकूलित राज्य में हैं और प्रेरक डोमेन की कमी है. बरकरार BphPs प्रभावी ढंग से परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) द्वारा अध्ययन किया जाना बहुत बड़ी हैं और एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए (विशेष रूप से प्रकाश अनुकूलित राज्य में) उनके अक्षुण्ण रूप में मणिभ को बेहद मुश्किल हैं. BphPs हाल ही में अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर के रूप में इंजीनियर किया गया है (आईपीएफ के). इन प्रोटीनों की 31 संरचनात्मक लक्षण वर्णन प्रभावी IFP डिजाइन में सहायता को आगे कर सकते हैं. 32-36
इस लेख का ध्यान केंद्रित करने के लिए एक प्रक्रिया मौजूद हैपीएफ-QNM के माध्यम से तरल सेल AFM का उपयोग BphPs की इमेजिंग. विधि संश्लेषक जीवाणु आर से bacteriophytochrome RpBphP3 (पी 3) के प्रकाश अनुकूलित राज्य के अध्ययन के द्वारा प्रदर्शन किया है palustris. यहाँ प्रस्तुत AFM प्रक्रिया प्रोटीन की इमेजिंग के लिए सुविधाजनक और सरल दृष्टिकोण के साथ ही अन्य जैविक अणुओं है. इस विधि के साथ, व्यक्तिगत अणुओं की संरचनात्मक विवरण एक उच्च स्तर के विज्ञान पाठ्यक्रम प्रयोगशाला सत्र के लिए इसी तरह समय की एक छोटी अवधि में एकत्र किया जा सकता है. पार वर्गों को मापने और आगे आयामी विश्लेषण पूरा करने के माध्यम से, प्रयोगात्मक डेटा उपयोगी कम्प्यूटेशनल मॉडल की तुलना में किया जा सकता है. 37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM physiologically प्रासंगिक परिस्थितियों में प्रोटीन और अन्य जैविक अणुओं इमेजिंग की पूरी तरह से सक्षम एक स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी विधि है. एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर की तुलना में, AFM की एक सीमा में एक ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NSF-एमआरआई कार्यक्रम (चे: 1229103) नई नियंत्रण इलेक्ट्रॉनिक्स, सॉफ्टवेयर, तरल कोशिकाओं, और एक दोहरी AFM / एसटीएम इकट्ठा करने के लिए आवश्यक अन्य उपकरणों की खरीद के वित्तपोषण के लिए स्वीकार किया है. हम AFM उपकरण, प्रशिक्षण, और इमेजिंग के साथ सहायता के लिए शिकागो NSF-MRSEC कार्यक्रम के विश्वविद्यालय (DMR-0820054) पर साझा सुविधाओं को स्वीकार करते हैं, और साधन समय के लिए सामग्री अनुसंधान सुविधाएं नेटवर्क (DMR-0820054) द्वारा उपलब्ध कराया. हम विशेष रूप से हमारे परिसर में आवश्यक इंस्ट्रूमेंटेशन लाया कि NSF-एमआरआई प्रस्ताव के वित्त पोषण से पहले हमारे छात्रों के स्वागत के लिए डॉ Qiti गुओ, डॉ जस्टिन Jureller, और प्रो का यी ली को धन्यवाद. उपभोज्य आपूर्ति के लिए गर्मियों में शोध छात्रों और संकाय के लिए छात्रवृत्ति के रूप में भी सहायता प्रदान की है कि पूर्वोत्तर इलिनोइस विश्वविद्यालय के लिए सम्मानित किया: (P031C110157 आईडी) हम एक शीर्षक III स्टेम अनुदान से धन स्वीकार करते हैं. अंत में, हम जारी रखा वाद्य समर्थन के लिए और अनुसंधान करने की अनुमति के लिए Bruker नैनो, इंक स्वीकार करते हैंPeakForce QNM के तंत्र दिखा एक साजिश eproduce और स्वचालित सॉफ्टवेयर का वर्णन करने के लिए शब्द ScanAsyst उपयोग करने के लिए.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
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