Fabriceren Complex Cultuur Substrates behulp Robotic Microcontact Printing (R-μCP) en Sequential Nucleofiele Substitutie

Summary

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Abstract

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Introduction

Het vermogen van PEG-geënte oppervlakken covalent gebonden biochemische liganden geven en tegelijkertijd het handhaven van inherent niet-fouling eigenschappen maken ze een ideale keuze voor techniek aangepaste microschaal omgevingen op cultuur substraten ^1,2,3. De biospecifieke interacties gemedieerd door ligand geconjugeerd PEG borstels maakt reductionistische analyse van de effecten van biochemische signalen binnen complex in vivo weefsel microenvironments op individuele cel fenotypes. Bovendien kan bio-orthogonaal "click" chemie worden gebruikt om gericht immobilisatie van liganden, zodat zij worden gepresenteerd in natieve conformaties ^4-6. Zo microschaal ruimtelijke patronen van PEG borstels is een veelzijdige tool om designer in vitro niches creëren om cell signaling geïnduceerd door geïmmobiliseerd biochemische ^6,7 signalen te onderzoeken.

Een gebruikelijke methode voor het genereren van ruimtelijke patronen van biochemische cues meebrengt microcontactprinten (μCP) goud gecoate substraten met patronen van PEG geconjugeerde alkaanthiolen. Vervolgens de micropatterned monolaag (SAM) van PEG-ylated alkaanthiolen beperkt fysische adsorptie van biochemische moleculen, zoals eiwitten, alleen zonder patroon gebieden van het substraat ^8,9. Echter, de opbrengst van deze techniek SAM's zijn gevoelig voor oxidatie in lange termijn celcultuur media. Aldus μCP'd alkaanthiol SAMs vaak verder geënt met PEG polymeerborstels met oppervlak geïnitieerde atoomoverdrachtsradicaalpolymerisatie (SI-ATRP) de regio aangroeiloze stabiliteit ¹⁰ verhogen. Specifiek μCP van de alkaanthiol polymerisatie-initiator, ω-meraptoundecyl broomisobutyraat op goud gecoate oppervlakken gevolgd door SI ATRP-poly (ethyleenglycol) methyl ether methacrylaat (PEGMEMA) monomeren genereert oppervlakken micropatterned lange termijn stabiele en niet- fouling PEG borstels. Bovendien zijn deze kunnen worden gewijzigd naar aanleiding van diverse chemische eenheden ¹¹ aanwezig.

Gebruik te maken van deze eigenschap, Sha et. al. een methode ontwikkeld om de cultuur substraten met meerdere componenten PEGMEMA borstels presenteren orthogonaal "click" chemie engineer. Bij deze werkwijze gebruikt men een reeks μCP / SI-ATRP stappen afgewisseld met sequentiële natriumazide, ethanolamine en propargylamine nucleofiele substituties cultuur substraten presenteren microschaal patronen van meerdere geïmmobiliseerde liganden ⁶ maken. Terwijl de mogelijkheden van het gebruik van dergelijke chemie in combinatie met handmatige μCP op nieuwe cultuur substraten ingenieur is enorm, wordt beperkt door de precisie en nauwkeurigheid waarmee meerdere μCP stappen kunnen worden uitgelijnd op een enkel substraat. Een hoog niveau van precisie en nauwkeurigheid zou moeten reproduceerbaar vervaardigen complex in vitro nissen met deze veelzijdige technieken.

e_content "> Om deze beperking te pakken, zijn er verschillende geautomatiseerde en semi-geautomatiseerde μCP systemen gegenereerd. Chakra et. al. ontwikkelden een μCP systeem waarin aangepaste stempels op een railsysteem worden geplaatst en bracht in conforme contact met goud gecoate dia's met behulp een computergestuurde pneumatische actuator. Deze werkwijze vereist de precieze fabricage van eigen stempel ontwerpen en meldt 10 micrometer nauwkeurigheid geen melding van de bereikte nauwkeurigheid bij het ​​uitvoeren van meerdere μCP stap ^12. Meer recent is een methode waarbij een geïntegreerd kinematische koppelsysteem gemeld precisie dan 1 urn met één patroon, maar konden meerdere patronen nauwkeurig uitlijnen door een gebrek aan nauwkeurige controle stempel functies van matrijs vormen ^13. Bovendien beide vorige methoden vereisen het substraat vast blijven tussen patroonvorming stappen waardoor aanzienlijk beperken van de diversiteit van oppervlaktemodificatie chemie die kunnen wordengebruikt. Hier beschrijven we een geautomatiseerde R-μCP systeem dat in staat accurate en nauwkeurige uitlijning van meerdere μCP stappen terwijl het toestaan ​​van maximale flexibiliteit in het stempel ontwerp en fabricage. Bovendien kan de gevormde substraten herhaaldelijk worden verwijderd uit het systeem van stampen, waarbij het gebruik van diverse substraat wijziging verbindingen, inclusief opeenvolgende nucleofiele substituties toelaat. Substraten ontwikkeld die dergelijke chemie zijn gebruikt voor celkweek eerder door zowel ons ^6,14 en ⁷ anderen. Zo hebben we R-μCP en sequentiële nucleofiele substitutiereacties samengevoegd tot een werkwijze voor schaalbare vervaardiging van cultuur substraten met complexe en micropatterned biochemische signalen ontwikkelen.

Protocol

1. Genereren Elastomeric Postzegels Om de PDMS stempel van silicium meesters te genereren, het ontwerp van de photomask's functie patronen met behulp van computer-aided design software. Ontwerp van het eerste patroon als een 20 x 20 matrix van annuli 300 urn inwendige diameter (ID) en 600 micrometer OD van 1,200 urn hart op hart afstand. Het ontwerp van de tweede patroon als een 20 x 20 matrix van annuli met 600 micrometer ID en 900 micrometer OD met 1,200 mic…

Representative Results

Het gebruik van handmatige aanpassing μCP technieken cultuur substraten met arrays van PEG-geënte borstels gefunctionaliseerd met orthogonale engineering "klik" chemie is in voorafgaand werk 6. Dit biedt echter weinig controle patroon oriëntatie en vaak resulteert in overlap van gefunctionaliseerde gebieden. Hier wordt een nieuw R-μCP systeem om deze beperking te overwinnen, en het accuraat patroon een reeks PEG borstel annuli 300 urn en 600 urn ID OD presenteren eindstandige alkyngroepen in een…

Discussion

Ideaal substraten voor tissue engineering zou worden bioinspired en daardoor recapituleren de ruimtelijke verdeling van kritische bioactieve liganden gevonden binnen de cellen. Ook zou bezitten dynamiek die tijdelijke aanpassing van de liganden en de ruimtelijke patronen waarin zij worden aangeboden aan gerichte weefsel morfogenese toe en ruimtelijk beperkte inductie van lot van de cel mogelijk maken. Fabricage van dergelijke substraten vereist het immobiliseren van meerdere biochemische signalen in complexe en zeer geo…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SCARA	Epson	LS3-401ST	Higher end models with increased precision are available if desired.
(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE	Gelest	SIT8174.0	CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides	Fisher Scientific	48393106	These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator	Telemark	SEC-600-RAP	Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate	Prochimia	FT 015-m11-0.2	Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities.
Schlenk Tube Flask 50 mL	Synthware	60003-078	Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate	Sigma Aldrich	447943	Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS)	Fisher Scientific	A412-4	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide	Sigma Aldrich	437867	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2',2-Bipyridine	Sigma Aldrich	D216305	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate	Sigma Aldrich	A4034
20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials	Fisher Scientific	03-340-4E
Sodium Azide	Sigma Aldrich	S2002	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide	Sigma Aldrich	227056	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine	Sigma Aldrich	398136	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine	Sigma Aldrich	T0886	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	276855	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine	Sigma Aldrich	P50900	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol	University of Wisconsin Material Distribution Services	2292	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin	ClickChemistryTools	AZ104-100	Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate	Sigma Aldrich	C1297	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
L-Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A7506
Phosphate Buffer Saline	Invitrogen	14190144
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663	Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate	Thermo Scientifit – NUNC	07-200-81	Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin	Clickchemistytools	A105P4-10	Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate	Life Technologies	S-11223	Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	S-11225	Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope	Nikon	Nikon Eclipse Ti, A1R	An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.