로봇 미세 접촉 인쇄 (R-μCP)를 사용하여 복합 문화 기판 및 순차 친 핵성 치환 제조
Summary
Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.
Abstract
In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.
Introduction
동시에 고유의 비 오염 특성을 유지하면서 공유 결합 생화학 적 리간드를 표시 PEG-이식 표면의 능력은 그들 문화 기판 1,2,3에 엔지니어링 사용자 정의 마이크로 환경을위한 이상적인 선택이 될 것입니다. 리간드 결합 PEG 브러쉬에 의해 매개 생물 특이 상호 작용은 개별 세포의 표현형에 생체 조직의 미세 환경에서 복잡한 내에서 발견 생화학 적 단서의 효과의 축소 된 분석을 할 수 있습니다. 또한, 바이오 – 직교 "클릭"화학 그들이 천연 배좌 4-6로 표시되도록 리간드의 고정화 지향성을 용이하게하는데 사용될 수있다. 따라서, PEG의 마이크로 공간 패턴 브러쉬 고정 생화학 적 단서 6,7에 의해 유도되는 세포 신호를 조사하기 위해 체외 틈새에서 디자이너를 만들 수있는 다양한 도구입니다.
생화학 세제곱의 공간 패턴을 생성하기위한 일반적인 방법ES는 PEG 복합 알칸 티올의 패턴으로 미세 접촉 인쇄 (μCP) 골드 코팅 된 기판을 수반한다. 그런 다음, PEG-ylated 알칸 티올의 미세 패턴 자기 조립 단분자층 (SAM을)은 만 8,9 기판의 패터닝되지 않은 지역으로, 생화학 분자, 예를 들어, 단백질의 물리적 흡착을 제한합니다. 그러나,이 기술에 의해 생성 된 SAM을 장기 세포 배양 배지에서 산화에 민감하다. 따라서, SAM에 알칸 티올 μCP'd은 종종 더 지역의 비 오염 안정성 (10)을 높이기 위해 표면 시작한 원자 이동 라디칼 중합 (SI-ATRP)을 사용하여 PEG 폴리머 브러시로 이식된다. 구체적 μCP는 알칸 티올 중합 개시제, 폴리 SI-ATRP (에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타 크릴 레이트 (PEGMEMA) 모노머 이어 금 – 코팅 된 표면에 ω-meraptoundecyl의 모이 소 부티레이트은, 미세 패턴 장기간, 안정적이며 비와 표면을 생성 오염 PEG 브러쉬. 또한,이 상기 다양한 화학 잔기 (11)를 제시하도록 변형 될 수있다.
이 속성, 샤 등을 활용. 알. 직교 "클릭"화학을 제시 성분 PEGMEMA 브러쉬와 문화 기판을 설계하는 방법을 개발했다. 이 방법에서는, 그들은 순차적 아 지드 화 나트륨, 에탄올 산재 μCP / SI-ATRP 일련의 단계를 사용하여, 복수 고정화 리간드 (6)의 마이크로 패턴을 제시 배양 기질을 만드는 핵성 치환을 propargylamine. 신규 배양 기판을 설계 할 μCP 설명서와 함께 이러한 화학 제를 사용하는 가능성이 엄청난이지만, 여러 μCP 단계들이 단일 기판 상에 정렬 될 수있는 정밀도 및 정확도에 의해 제한된다. 정밀도와 정확도가 높은 재현성이 다용도 기법을 이용하여 시험 관내에서 틈새 착체를 제조하는 것이 필요할 것이다.
e_content가 "> 이러한 한계를 해결하기 위해, 여러 자동 및 반자동 μCP 시스템 알.. 차크라 등. 생성 된 사용자 정의 스탬프 레일 시스템 상에 배치하여 금 – 코팅 슬라이드와 등각 접촉되는 μCP 시스템이 개발되어왔다 컴퓨터로 제어되는 공기압 액츄에이터. 그러나,이 방법은 정의 스탬프 디자인의 정밀한 제작이 필요하며 다수 μCP 12 단계를 수행 할 때 실현 : 정확도 보고서 10 μm의 정밀도를보고한다. 최근에는 집적 키네마 틱 커플 링 시스템을 이용하는 방법을 보고 하나의 패턴을 사용하여 1 ㎛ 이하의 정밀도,하지만 인해 (13)을 성형하는 금형 스탬프 기능을 정밀하게 제어의 부족으로 정확히 여러 패턴을 정렬 할 수 없습니다. 또한, 이전의 방법 모두 패터닝 단계 사이에 고정 된 상태로 유지하기 위해 기판을 필요로 함으로써 크게 될 수 표면 개질 화학의 다양성을 제한이용했다. 스탬프 디자인과 제조에있어서 최대의 유연성을 허용하면서 여기서는 μCP 여러 단계의 정확하고 정밀한 정렬 자동화 R-μCP 시스템이 할 설명한다. 또한, 패터닝 된 기판을 반복하여 순차 핵성 치환을 포함한 다양한 기판 변형 화학의 사용을 허용하는, 스탬핑 사이의 시스템으로부터 제거 될 수있다. 이러한 화학 물질을 사용하여 설계 기판은 우리 모두 6,14 등 7 이전에 세포 배양에 사용되어왔다. 따라서, 우리는 복잡하고 미세 패턴 생화학 단서와 함께 배양 기판의 확장 제조 방법을 개발하기 위해 R-μCP 순차적 친 핵성 치환 반응을 병합 하였다.Protocol
Representative Results
Discussion
조직 공학을위한 이상적인 기판 bioinspired하여 기본 조직 내에서 발견 중요한 생리 활성 리간드의 공간적 분포 요점을 되풀이 할 것이다. 또한 리간드의 시간적 조정 그들이 향하는 조직 형태 형성을 허용하기 위해 제시 공간적 세포 운명의 제한을 유도하는 공간 패턴을 가능하게 동적 특성을 갖는다 것이다. 이러한 기판의 제조는 기판에 복잡하고 높은 순서 방향에서 여러 생화학 적 단서의 고정?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 mL | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2',2-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit – NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
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