रोबोट microcontact मुद्रण (आर-μCP) का प्रयोग परिसर संस्कृति substrates और अनुक्रमिक न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन fabricating
Summary
Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.
Abstract
In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.
Introduction
एक साथ निहित गैर-दूषण गुण को बनाए रखते हुए covalently बाध्य जैव रासायनिक ligands के प्रदर्शित करने के लिए खूंटी grafted सतहों की क्षमता उन्हें संस्कृति substrates 1,2,3 पर इंजीनियरिंग कस्टम microscale वातावरण के लिए एक आदर्श विकल्प है. ligand के संयुग्मित खूंटी ब्रश द्वारा मध्यस्थता biospecific बातचीत व्यक्ति सेल phenotypes पर विवो ऊतक microenvironments में परिसर के भीतर पाया जैव रासायनिक संकेतों के प्रभाव के reductionistic विश्लेषण में सक्षम बनाता है. इसके अलावा, जैव ओर्थोगोनल "क्लिक" chemistries वे देशी रचना 4-6 में प्रस्तुत कर रहे हैं कि इतने ligands के दिशात्मक स्थिरीकरण की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, खूंटी के microscale स्थानिक patterning के ब्रश स्थिर जैव रासायनिक संकेतों 6,7 द्वारा प्रेरित सेल संकेतन जांच करने के लिए इन विट्रो आलों में डिजाइनर बनाने के लिए एक बहुमुखी उपकरण है.
जैव रासायनिक घन के स्थानिक पैटर्न पैदा करने के लिए एक आम तरीकातों खूंटी संयुग्मित alkanethiols के पैटर्न के साथ microcontact मुद्रण (μCP) सोने में लिपटे substrates के जरूरत पर जोर देता. फिर, खूंटी ylated alkanethiols की micropatterned आत्म इकट्ठे monolayers (SAMs) केवल सब्सट्रेट 8,9 की गैर नमूनों क्षेत्रों के लिए, जैव रासायनिक अणुओं, जैसे, प्रोटीन की शारीरिक सोखना प्रतिबंधित करता है. हालांकि, इस तकनीक के द्वारा उत्पन्न SAMs दीर्घकालिक सेल संस्कृति मीडिया में ऑक्सीकरण के प्रति संवेदनशील हैं. इस प्रकार, Sams alkanethiol μCP'd अक्सर आगे इस क्षेत्र की गैर-दूषण स्थिरता 10 को बढ़ाने के लिए सतह शुरू की परमाणु हस्तांतरण कट्टरपंथी polymerization (एसआई-ATRP) का उपयोग खूंटी बहुलक ब्रश के साथ grafted रहे हैं. विशेष रूप से, μCP alkanethiol polymerization के सर्जक की, पाली के एसआई-ATRP (इथाइलीन ग्लाइकॉल) मिथाइल ईथर methacrylate (PEGMEMA) मोनोमर्स द्वारा पीछा सोने में लिपटे सतहों पर ω-meraptoundecyl bromoisobutyrate, micropatterned लंबी अवधि, स्थिर, और गैर साथ सतहों उत्पन्न दूषण खूंटी ब्रश. इसके अलावा, इन आगे विविध रासायनिक moieties 11 पेश करने के लिए संशोधित किया जा रहा करने में सक्षम हैं.
इस संपत्ति, शा एट का लाभ ले. अल. ओर्थोगोनल "क्लिक" chemistries पेश multicomponent PEGMEMA ब्रश के साथ संस्कृति substrates इंजीनियर एक विधि विकसित की है. इस विधि में, वे अनुक्रमिक सोडियम azide, ethanolamine साथ interspersed μCP / सी ATRP कदम की एक श्रृंखला का उपयोग, और कई स्थिर ligands के 6 के microscale पैटर्न पेश संस्कृति substrates बनाने के लिए न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन propargylamine. उपन्यास संस्कृति substrates इंजीनियर पुस्तिका μCP के साथ संयोजन के रूप में इस तरह के chemistries का उपयोग करने की क्षमता अपार है, यह कई μCP कदम एक एकल सब्सट्रेट पर गठबंधन किया जा सकता है जिसके साथ सटीक और सटीकता के द्वारा सीमित है. परिशुद्धता और सटीकता की एक उच्च स्तर reproducibly इन बहुमुखी तकनीक का उपयोग कर इन विट्रो आलों में जटिल निर्माण की आवश्यकता होगी.
e_content "> इस सीमा को संबोधित करने के लिए, कई स्वचालित और अर्द्ध स्वचालित μCP सिस्टम अल.. चक्र एट. उत्पन्न कस्टम टिकटें एक रेल प्रणाली पर रखा गया है और उपयोग कर सोने में लिपटे स्लाइड के साथ conformal के संपर्क में लाया जाता है, जिसमें एक μCP प्रणाली विकसित की गई है एक कंप्यूटर नियंत्रित वायवीय actuator. हालांकि, इस विधि कस्टम स्टांप डिजाइन की सटीक निर्माण की आवश्यकता है और कई μCP 12 चरणों का प्रदर्शन जब हासिल की शुद्धता की कोई रिपोर्ट के साथ एक 10 माइक्रोन सटीक रिपोर्ट. अभी हाल ही में एक एकीकृत विज्ञान सम्बन्धी युग्मन प्रणाली का उपयोग एक विधि रिपोर्ट एक ही पैटर्न का उपयोग 1 माइक्रोन से नीचे परिशुद्धता, लेकिन कारण 13 मोल्ड करने के लिए मोल्ड से स्टाम्प सुविधाओं का सटीक नियंत्रण की कमी को सही रूप में कई पैटर्न संरेखित करने में असमर्थ थे. साथ ही, पिछले विधियों के दोनों patterning के चरणों के बीच रहने के लिए निर्धारित सब्सट्रेट की आवश्यकता , जिससे काफी हो सकता है कि सतह संशोधन chemistries की विविधता सीमितका उपयोग किया. स्टाम्प डिजाइन और निर्माण में अधिक से अधिक लचीलेपन की अनुमति है, जबकि यहाँ, हम कई μCP चरणों की सही और सटीक संरेखण के एक स्वचालित आर-μCP प्रणाली सक्षम वर्णन. इसके अलावा, नमूनों substrates के बार बार इस तरह अनुक्रमिक न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन सहित विभिन्न सब्सट्रेट संशोधन chemistries, के उपयोग की अनुमति, स्टांपिंग के बीच प्रणाली से हटाया जा सकता है. ऐसे chemistries का उपयोग कर इंजीनियर substrates दोनों हमें 6,14 और दूसरों 7 से पहले सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रकार, हम जटिल और micropatterned जैव रासायनिक संकेतों के साथ संस्कृति substrates के स्केलेबल निर्माण के लिए एक विधि विकसित करने के लिए आर-μCP और अनुक्रमिक न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन प्रतिक्रियाओं विलय कर दिया है.Protocol
Representative Results
Discussion
ऊतक इंजीनियरिंग के लिए आदर्श substrates के bioinspired और इस तरह देशी ऊतकों के भीतर पाया महत्वपूर्ण बायोएक्टिव ligands के स्थानिक वितरण पुनरावृत्ति की जाएगी. उन्होंने यह भी ligands के अस्थायी समायोजन और वे निर्देशित ऊतक morphogen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 mL | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2',2-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit – NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
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