We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
살아있는 세포에 단일 분자의 역학은 생물학적 기능에 기여한다. 단일 분자 형광 이미징은 세포 표면 1,2,3에 단일 분자 역학을 연구하는 인기있는 방법입니다. 그러나, 이러한 연구에 가장 흔히 사용되는 이미징 프로브는 몇몇 중요한 단점이있다. 예를 들어, 종래의 유기 염료와 형광 단백질 -1 10 5 -10 6 M, cm -1 적당한 밝기를 제공하지만, 광 화학적으로 불안정하여, 전형적인 라이브 세포 이미징 조건 하에서 약 105 -10 6 광자 방출 후 표백 4,5. 대조적으로, 반도체 나노 입자, 양자점 자주 호출 (양자점), 10 (6) -10 (7) M -1 cm -1의 범위 photobl 전에 10 7 -10 8 방출 광자를 초과의 흡광 계수와 상당히 더 밝고 안정한5 eaching. 유기 형광 물질을 통해 양자점의 개선 된 밝기와 광 안정성은 훨씬 빠른 프레임 속도에서 단일 분자의 관찰을 통해 더 이상 6 탄도를 가능하게한다.
자신의 장점과 상용화에도 불구하고, 여러 부채는 이러한 강력한 이미징 에이전트 남아있다. 첫째, 그들은 가난 대상으로 생체 분자 6의 가교가 발생할 수 있습니다 대상 원자가를 정의했습니다. 둘째, 일반적으로 특정 붐비는 세포 환경 7 접근성을 제한하는 큰 유체 역학적 크기 (> 20 nm의)를 가지고있다. 셋째, 이들은 모듈화 7 타겟팅 제한. 몇 가지 전략은 이러한 문제 8,9,10를 해결하기 위해 시도하지만, 일반적으로 구현하기 위해 전문 지식과 시약을 필요로했다.
이러한 문제를 해결하기 위해 최근 가의가 작은 제조 "입체 제외"전략을보고하고,모듈 형 양자점 11. 양자점은 하나의 긴 포스 DNA (ptDNA) 폴리머와 함께 포장되어 있습니다. ptDNA 표면 노출 아연 원자 및 ptDNA 중합체의 포스 그룹 간의 여러 Zn으로 S-상호 작용을 통해 QD 표면에 결합한다. 단일 결합 중합체는 입체 및 정전 크게 입자의 전체 크기 (약 2 나노 미터)를 증가시키지 않고, 중합체의 추가 당량의 결합을 제외한다. 모든 시약은 제품을 높은 수율로 형성되고, 시판되고, 처리는 오직 탈염 정제 단계를 필요로한다. 일단, 대상 도메인 (예를 들어, benzylguanine (BG), benzylcytosine 또는 alkylhalides)가있는 보완적인 DNA 가닥에 대한 단일 ptDNA (mQDs) 바인드으로 포장 양자점을 표시.
이 기능은 유 전적으로 관심의 단백질에 융합 등 SNAP, CLIP & HALO 등의 효소 태그에 특별히 mQDs을 대상으로. 이것은 합성 프로토콜, 타겟팅, 그리고 입체 배제에 의해 생산 mQDs의 라이브 세포 이미징.
mQD 설계의 모듈은 실험적인 유연성의 증가 정도를 할 수 있습니다. 예를 들어, mQDs 다양한 빨리 복수의 타겟의 동시 촬상을 가능하게 고유 한 색상으로 제조 할 수있다. ssDNA를 대상 시퀀스는 단백질 당 12, 지질 mQDs을 지시하고 13을 표면 수 있습니다. 효소 태그의 수는 여러 대상이 차등 대상 mQDs과 동시에 이미지를 만들 수 있도록 직교 반응성 사용할 수 있습니다. SNAP 태그 타겟팅 외에도 CLIP 태그, HALO 태그를 사용 mQDs 및 바이오틴 단백질과 목적 단백질의 라벨은 또한 성공적이었다. 이 프로토콜은 이러한 mQDs와 생균상의 표면 수용체의 특정 라벨을 설명하지만, 프로토콜은 쉽게 다른 컨텍스트의 수에 적응 될 수있다.
정의 가의 mQDs 생산에 중요한 방법 론적 통찰력입니다 ~ 50 포스는 링크기지는 양자점을 래핑 (그리고 동시에 바인딩이 분자를 방지)해야합니다. 폴리 S (50) 순서는 재현성 및 안정적 생활 기술에서 605 나노 양자점을 결합. 이 제품은 단종되었지만, 입체 배제 전략은 서로 다른 크기, 모양, 스펙트럼 특성을 갖는 다른 공급 업체의 유사 제품에 일반화이다.
ptDNA 포장 된 양자점의 효율과 안정성은 양자점의 표면 화학 구조에 따라 크게 달라진다. 따라서, 프로토콜의 성공은 양자점의 상업적인 소스 및 화학 구조에 의존 할 것이다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 차의 세 가지 주요 포인트는 양자점의 다양한 상업적인 소스간에 존재 상전이에 필요한 조건의 차이; ptDNA에 의해 초기 PEG-티올 – 리간드 결합, 아마도 방해 변위의 강도의 차이; 노출 된 CdSe 코어의 양의 차이, 어떤 수 르티올은 MPEG 상 전이 조건 QD의 급냉에 등록.
간행물로, mQDs의 생산을위한 최적의 구조를 가진 양자점은 545, 585, 605 및 625 nm의 (그림 2A)에서 방출 스펙트럼과 생활 기술에서 구입 한 4-10 나노 미터의 CdSe /의 ZnS 코어 / 쉘 양자점이다. '생생한'제제 (545, 605 등)에 따라 양자점에는 MPEG 티올의 추가에 해소 및이 응용 프로그램에 적합하지 않습니다. 알드리치 해양 나노텍에서 양자점은 잘 작동하지만, 더 이상 상 전이 단계와 트리 옥틸 산화물로 전처리를 필요로합니다. 이 프로토콜은 라이프 테크놀로지스의 양자점에 최적화되어 있습니다.
양자점을 포장하는 데 사용되는 폴리-A 서열을 포스 표적 가닥에 혼성화 할 수있는 (ACTG) (5)의 서열을 함유 네이티브 20 량체의 DNA 테일로 종결된다. 이 시퀀스는 더 차 구조에 거의 없다로, 편리하고, hybridiz 남아PBS에서 37 ° C에서의 에디션. DNA 합성기에 대한 액세스가있는 경우 ptDNA는 C 8 컬럼을 사용하여 합성 한 후 역상 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC)로 정제 할 수있다. ptDNA는 기본 백본 해당하는 올리고 뉴클레오티드보다 HPLC 나중에 용출됩니다. 우리는 일반적으로 정제 한 후 우리의 포스 올리고 뉴클레오티드에 그룹을 보호 DMT '5 둡니다.
ptDNA 감싸 양자점의 패시베이션은 일반적 양자점 콜로이드 안정성 향상 및 대부분의 응용에 대한 실험적 바인딩 배경을 감소시키기 위해 필요하다. 프로토콜은 양자점 보호막을하기 위해 PEG-층을 사용한다. 카르복시 PEG 추가 PEG 단위로 알칸 티올 ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 12 C 11 H 23의 SH, 카르복시 PEG12 알칸 티올이) 상당히 배경을 감소 제공 긴 나무못은 모두 큰 불구하고, 일반적으로 더 비싼. 카복시 PEG 알카 코팅 mQDs북동 티올 리간드는 인산염 완충 살리 네스와 문화 매체로 생리 버퍼 매우 안정적이다. 4 ° C에서 mQDs의 장기 저장 (> 7 개월) 유의 집계 또는 ptDNA 부대 11 없었다. 실험에 따라, 양자점의 PEG의 보호는 항상 혼자 충분히 비 특정 mQDs의 결합을 감소하지 않습니다. 이 50 % ~ 의해 mQDs의 외관상 유체 역학적 반경을 증가 않지만 실질적으로 사용하기 전에 20 분 동안 3 % BSA를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)으로 세포 mQDs 모두 배양하면, 세포에 결합하는 비특이적 감소시킨다. 0.5 % 카제인과 패시베이션은 비특이적 결합이 더욱 감소하지만 BSA보다 큰 정도로 겉보기 크기를 증가시킨다.
mQDs에 상보적인 DNA 가닥의 5 '말단이 다른 생체 분자의 다수의 타겟팅 있도록 수정 될 수있다. 공유 결합 단백질을 수정은 가능 설정된 다수의 기술, L이있다ipids 및 단일 가닥 DNA (ssDNA를)와 당. ssDNA를이 세포 외로 제시로 너무 오래, 그것은 수용성 mQDs에 액세스 할 수 있습니다. 상기 시퀀스 mQDs 빠르게 세포 배양 조건 하에서 그들의 상보 적 DNA 가닥으로 혼성화 할 것이다. 셀의 두께와 음으로 하전 된 글리코 칼 릭스 위에 결합 서열을 상승하도록 ptDNA 및 표적 서열 사이 10-20x 폴리 (CT)은 스페이서 효율적인 타겟팅을 위해 필요할 수있다. 이 프로토콜을 위해 우리 모두 mQDs 하이브리드 화 및 공유 신속하고 특정 라벨에 대한 SNAP – 태그 단백질에 자신을 연결됩니다 (CAGT) 5의 상보 서열과 BG-DNA를 생산하기로 결정했습니다. 잘 아미노 변성 올리고 뉴클레오티드 다른 NHS-에스테르 결합하기위한 유사한 프로토콜 기능을 제공합니다.
단일 분자 이미징의 경우, 라벨의 낮은 밀도는 일반적으로 개별 분자를 해결하기 위해 필요합니다. 패시 에이전트 PBS에서 ~ 0.5 ㎚의 최종 농도 mQD좋은 대상이다. 그러나 이러한 높은 희석 때로는 아래 표지 세포에서 발생했습니다. 이 경우 라벨의 최적 농도가 관찰 될 때까지, 추가 mQD 첨가 할 수있다. 0.5 nm의 mQD 타겟 셀의 기저 표면에서 20 mQDs (그림 (b) 참조) ~의 첨부 파일에 결과 동안 SNAP-태그 인간 Notch1의 경우,> 10 nM의 mQD의 농도는 밀도 라벨 세포를 생산했다. mQDs와 셀 라벨 도금 세포의 포화 상태의 매우 의존적이었다. 지나치게 합류 세포는 기저 표면에 레이블을하지 않습니다.
요약하면, 간단한 방법은 일가를 생성하는 모듈러 양자점 설명 하였다. 라이브 U2OS 세포의 노치 수용체를 영상화에 의해 입증 이러한 mQDs는 라이브 세포 이미징 응용 프로그램의 다양한 유틸리티를 찾을 수 있습니다. mQDs의 적용은 이러한 특정 경우에 한정되지 않고, 잠재적으로 다른 단백질, 핵산, 효소와 같은 다른 셀룰러 대상에 대해 확장 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
DOD W81XWH-1023년 10월 1일 (ZJG) 시스템을위한 UCSF 센터 및 합성 생물학 (ZJG)에서 부여 P50의 GM081879, NIH 5R21EB015088-02 (YJ)와 NIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ)가 제공하는 자금. DS는 인간 프론티어 과학 프로그램 크로스 – 징계 박사 후 연구원 연구 친교에 의해 지원되었다.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |