We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
הדינמיקה של מולקולות בודדות על תאי חיים תורמת לתפקוד הביולוגי שלהם. דימות פלואורסצנטי המולקולה בודדת היא שיטה פופולרית ללמוד דינמיקת מולקולה בודדת על 1,2,3 פני התא. עם זאת, יש לי בדיקות ההדמיה הנפוצות ביותר במחקרים אלה יש כמה חסרונות חשובים. לדוגמא, צבעים אורגניים קונבנציונליים וחלבוני ניאון לספק בהירות מתונה, על 10 5 -10 6 M -1 cm -1, אבל הם לא יציבים photochemically, הלבנה לאחר הפליטה של כ 10 5 -10 6 פוטונים בתנאי הדמיה לחיות תאים טיפוסיים 4,5. בניגוד לכך, חלקיקים מוליכים למחצה, נקודות קוונטיות בתדירות גבוהה נקראות (QDs), הם בהירים באופן משמעותי ויציבים יותר, עם מקדמי הכחדה בטווח של 10 -1 6 -10 7 M -1 סנטימטר ועולה על 10 7 -10 8 פוטונים הנפלטים לפני photobleaching 5. הבהירות וphotostability המשופרת של QDs מעל fluorophores האורגני מאפשרים התצפית של מולקולות בודדות במסגרת שיעורים מהירים יותר באופן משמעותי ועל הרבה יותר מסלולי 6.
למרות יתרונותיהם וזמינות מסחרית, כמה התחייבויות יישארו לסוכני הדמיה רבי עוצמה אלה. ראשית, יש להם בצורה גרועה מוגדר ולנסי מיקוד, אשר עלול לגרום לcrosslinking של מולקולות ביולוגיות ממוקדים 6. שני, בדרך כלל יש להם גודל גדול הידרודינמית (> 20 ננומטר) שמגביל את הנגישות לסביבות סלולריות צפופות מסוימות 7. שלישית, הם מוגבלים מיקוד מודולריות 7. כמה אסטרטגיות ניסו לטפל 8,9,10 בעיות אלה, אך בדרך כלל דורשות ידע וחומרים כימיים מיוחדים כדי ליישם.
כדי להתמודד עם בעיות אלה, אנו דיווחו לאחרונה על אסטרטגיה "הדרה סטרית" להכנה חד ערכי, קטן, ומודולרי QDs 11. QDs הם עטופים בפולימר יחיד DNA phosphorothioate הארוך (ptDNA). PtDNA נקשר למשטח QD דרך אינטראקציות Zn-S מרובים בין אטומי Zn משטח חשוף וקבוצות phosphorothioate של פולימר ptDNA. פולימר קשור אחד sterically ואלקטרוסטטי אינו כולל המחייב שווים נוסף של הפולימר מבלי להגדיל את הגודל הכולל של החלקיקים (כ 2 ננומטר) באופן משמעותי. כל ריאגנטים זמינים מסחרי, מוצרים נוצרים בתשואה גבוהה, והתהליך דורש רק צעדי desalting לטיהור. שכותרתו ברגע, QDs עטוף בלאגד ptDNA (mQDs) יחיד לגדילי דנ"א משלימים נושאות תחומים מיקוד (למשל, benzylguanine (BG), benzylcytosine, או alkylhalides).
הפונקציות הללו מיועדים לmQDs במיוחד כדי תגים האנזימטית כגון SNAP, CLIP & HALO הגנטי התמזגו החלבון של עניין. זהו פרוטוקול לסינתזה, מיקוד, והדמיה לחיות תאים של mQDs מיוצר על ידי הדרה סטרית.
המודולריות של עיצוב mQD מאפשרת מידה מוגברת של גמישות ניסיונית. לדוגמא, מגוון של mQDs ניתן להכין במהירות בצבעים ייחודיים המאפשרים להדמיה בו זמנית של מספר רב של מטרות. רצף מיקוד ssDNA יכול לכוון mQDs לחלבונים, סוכרים 12, שומנים ומשטחים 13. מספר התגים האנזימטית זמין עם reactivities מאונך, המאפשר מטרות מרובות להיות צילמו בו זמנית עם mQDs הממוקד באופן דיפרנציאלי. בנוסף למיקוד עם תג SNAP, תיוג של חלבוני יעד עם mQDs שימוש בתג CLIP, תג HALO, וחלבוני biotinylated היה גם מוצלח. פרוטוקול זה מדגים את התיוג הספציפי של קולט משטח על תאי חיים עם mQDs אלה, אבל הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם למספר הקשרים השונים.
תובנה מתודולוגיים המשמעותית בייצור mQDs עם ולנסי מוגדרים היא ש~ 50 phosphorothioate צמודבסיסים נדרשים לעטוף QDs (ובכך למנוע את שתי מולקולות מלהיקשר בו זמנית). -פולי רצף S 50 reproducibly ויציבות כרוך 605 QDs ננומטר מחי טכנולוגיות. למרות שמוצר זה הופסק, אסטרטגית ההדרה סטרית היא להכליל למוצרים דומים מיצרנים אחרים שיש בגדלים שונים, צורות, תכונות ספקטרליות.
היעילות והיציבות של QDs העטוף ptDNA תלויה באופן קריטי על הכימיה של פני השטח והמבנה של QDs. לכן, ההצלחה של פרוטוקול תהיה תלויה במבנה המקור וכימי המסחרי של QDs. למטרות פרוטוקול זה, שלוש נקודות עיקריות של הבדל קיים בין מקורות שונים מסחריים של QDs: הבדל בתנאים דרושים להעברת שלב; הבדל בכח של עקירה ראשונית מחייבת PEG-תיאול ליגנד, אולי פוגע בptDNA; והבדל בסך של ליבת CdSe חשופה, אשר יכול leמודעה למרווה של QD על ידי תנאי העברת שלב תיאול MPEG.
החל בפרסום, QDs עם המבנה הטוב ביותר לייצור של mQDs הוא 4-10 QDs CdSe ננומטר / ליבת ZnS / פגז שנרכש מחי טכנולוגיות עם ספקטרום פליטה ב545, 585, 605 & 625 ננומטר (איור 2 א). QDs מבוסס על הניסוח "Vivid" (545, 605, וכו ') להרוות על תוספת של תיאול MPEG ואינם מתאימים ליישום זה. QDs מאולדריץ והאוקיינוס ננוטק לעבוד היטב, אך דורש צעדי העברת שלב ארוך יותר וטיפול מקדים בתחמוצת trioctylphosphine. פרוטוקול זה כבר מותאם לQDs מחי טכנולוגיות.
רצף poly-phosphorothioate נהג לעטוף את QDs מסתיים עם זנב דנ"א יליד 20-mer המכיל את הרצף של (ACTG) 5 עד שגדיל מיקוד עשוי להכליא. רצף זה הוא נוח, שכן יש לא מעט על מנת מבנה משני, ויישאר hybridizעורך על 37 מעלות צלזיוס בPBS. אם יש גישה לסינתיסייזר DNA, ptDNA יכול על ידי מסונתז ולאחר מכן מטוהר על ידי כרומטוגרפיה הנוזלית ביצועים גבוהים שלב הפוך (HPLC) באמצעות טור C 8. PtDNA יהיה elute בהמשך HPLC מאשר oligonucleotides המקביל עם עמוד השדרה ילידים. אנחנו בדרך כלל לעזוב את 5 'DMT הגנת קבוצה על oligonucleotides phosphorothioate שלנו לאחר טיהור.
פסיבציה של QDs העטוף ptDNA נדרשת בדרך כלל כדי לשפר את יציבות colloidal של QDs ולהפחית את הרקע מחייב עבור יישומים הניסיוניים ביותר. הפרוטוקול עושה שימוש PEG-שכבה לpassivate QDs. Carboxy PEG תיאול האלקאן עם יחידות PEG נוסף ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 12 C 11 H SH 23, תיאול האלקאן carboxy-PEG12) מספק מופחת באופן משמעותי רקע, אם כי את היתדות כבר שניהם גדולות יותר, ובדרך כלל יקר יותר. mQDs מצופה carboxy PEG אלקההליגנדים תיאול ne הם מאוד יציבים במאגרים פיסיולוגיים כגון Salines פוספט שנאגרו ותקשורת ותרבות. אחסון לטווח ארוך (> 8 חודשים) של mQDs על 4 מעלות צלזיוס לא הראה צבירה משמעותית או ניתוק ptDNA 11. בהתאם לניסוי, פסיבציה PEG של QDs לבד לא תמיד מספיק להפחית הלא ספציפית מחייבת של mQDs. דוגרים שני תאים וmQDs בופר פוספט (PBS) המכיל BSA 3% עבור 20 דקות לפני השימוש מפחית באופן משמעותי שאינו ספציפי מחייב את תאים, למרות שזה מגדיל את הרדיוס הידרודינמית לכאורה של mQDs על ידי ~ 50%. פסיבציה עם קזאין 0.5% מפחיתה את הלא ספציפי מחייב עוד יותר אבל זה מגדיל את הגודל הנראית לעין ליותר מBSA במידה רבה יותר.
סוף '5 של גדיל DNA משלים לmQDs יכול להיות שונה כדי לאפשר מיקוד של מספר המולקולות הביולוגיים שונות. ישנן מספר טכניקות שהוקמו לרשות לשנות קוולנטית חלבונים, lipids וסוכרים עם דנ"א יחיד שנתקע (ssDNA). כל עוד ssDNA מוצג extracellularly, הוא נגיש לmQDs המסיס. mQDs עם הרצפים מעל מהירות יהיה להכליא עם גדיל DNA משלים בתנאי תרבית תאים. Spacer 10-20x ליזין (CT) בין ptDNA ורצף המיקוד עשוי להידרש ליעיל מיקוד כדי להגביה את הרצף מחייב מעל glycocalyx העבה והטעון שלילי של התא. לפרוטוקול זה בחרנו לייצר BG-DNA עם רצף משלים של (CAGT) 5 ששניהם הכלאה לmQDs וקוולנטית לקשר את עצמו לחלבון SNAP-תג לתיוג מהיר וספציפי. פונקציות פרוטוקול דומות גם לצימוד NHS-אסטרים אחרים לoligonucleotides-הותאם אמינו.
להדמית מולקולה בודדת, צפיפות נמוכה של תיוג נדרשת בדרך כלל כדי לפתור מולקולות בודדות. ריכוז סופי mQD של ~ 0.5 ננומטר בPBS עם סוכן passivatingהוא יעד טוב. עם זאת, דילולים גבוהים אלה לעתים הסתיימו בתחת תיוג של התאים. במקרה זה, ניתן להוסיף mQD נוסף עד צפיפות אופטימלית של תיוג הוא ציין. במקרה של Notch1 אדם מתויג SNAP, ריכוזים של> 10 ננומטר mQD מיוצרים תאי תיוג צפופים תוך 0.5 ננומטר mQD הביא את הקובץ המצורף של ~ 20 mQDs על פני השטח הבסיסיים של תא מטרה (ראה איור 4). תא תיוג עם mQDs היה תלוי במידה רבה של confluency של תאים מצופים. מדי תאים ומחוברות לא לתייג במשטחים הבסיסיים שלהם.
לסיכום, שיטה פשוטה ליצירה חד ערכי וQDs מודולרית תואר. mQDs אלה למצוא שירות במגוון רחב של יישומי הדמיה תא חיים, כפי שהודגם על ידי ההדמיה קולט Notch על תאי U2OS חיים. תחולתו של mQDs אינה מוגבלת למקרה הספציפי הזה, אבל יכולה באופן פוטנציאלי להיות מורחב למטרות סלולריות אחרות כגון חלבונים אחרים, חומצות גרעין, ואנזימים.
The authors have nothing to disclose.
מימון הניתן על ידי משרד ההגנה האמריקאי W81XWH-1023/10/1 (ZJG), GM081879 P50 מענק ממרכז קליפורניה בסן פרנסיסקו למערכות וביולוגיה סינתטית (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) וNIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ). DS נתמכה על ידי מענק מחקר פוסט דוקטורט משמעתי האדם Frontier Science Program Cross-.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |