We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
Die Dynamik einzelner Moleküle an lebenden Zellen beiträgt, ihre biologische Funktion. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Bildgebung ist eine beliebte Methode, um einzelne Molekül Dynamik auf der Zelloberfläche 1,2,3 studieren. Die am häufigsten verwendeten Bildgebungssonden in diesen Studien haben jedoch mehrere wesentliche Nachteile. Zum Beispiel herkömmliche organische Farbstoffe und fluoreszierende Proteine liefern moderate Helligkeit, etwa 10 5 bis 10 6 M -1 cm -1, sind aber photochemisch instabil, Bleichen nach der Emission von etwa 10 5 bis 10 6 Photonen unter typischen Live-Cell-Imaging Bedingungen 4,5. Im Gegensatz dazu Halbleiter-Nanopartikel, häufig als Quantenpunkte (QP), sind deutlich heller und stabil, mit Extinktionskoeffizienten im Bereich von 10 6 bis 10 7 M -1 cm -1, und mehr als 10 7 -10 8 emittierten Photonen vor photoblEACHING 5. Die verbesserte Helligkeit und Photo QDs über organische Farbstoffe ermöglicht die Beobachtung von einzelnen Molekülen zu deutlich schnellere Bildwiederholraten und über wesentlich längere Flugbahnen 6.
Trotz ihrer Vorteile und kommerzielle Verfügbarkeit, bleiben mehrere Verbindlichkeiten für diese leistungsfähige Imaging-Agenten. Erstens, sie schlecht definierten Ziel Wertigkeit, die Vernetzung der Biomoleküle gezielt 6 führen kann. Zweitens, sie haben in der Regel eine große hydrodynamische Größe (> 20 nm), die Zugänglichkeit zu bestimmten zellulären Umgebungen überfüllten 7 begrenzt. Drittens, sie beschränkt Targeting Modularität 7. Mehrere Strategien sind versucht, diese Probleme anzugehen 8,9,10, aber im Allgemeinen erfordern spezielle Kenntnisse und Reagenzien zu implementieren.
Um diese Probleme anzugehen, die vor kurzem beschrieben wir eine "sterische Ausschlußchromatographie" Strategie zur Herstellung einwertiger, klein, undmodulare QDs 11. Die QDs sind mit einem einzigen langen Phosphorothioat- DNA (ptDNA) Polymer gewickelt. Die ptDNA bindet an den QD-Oberfläche durch mehrere Zn-S-Wechselwirkungen zwischen oberflächenexponierten Zn-Atome und der Phosphorthioat-Gruppen des Polymers ptDNA. Ein einzelnes Polymer gebunden sterisch und elektrostatisch schließt die Bindung von zusätzlichen Mitteln des Polymers ohne Gesamtgröße des Partikels (ca. 2 nm) deutlich zu erhöhen. Alle Reagenzien sind im Handel erhältlich, Produkte in hoher Ausbeute gebildet wird, und das Verfahren erfordert nur Entsalzungsschritte zur Reinigung. Einmal markiert, QDs mit einem einzigen ptDNA (mQDs) binden an komplementäre DNA-Stränge Lager Targeting-Domains (zB Benzylguanin (BG), benzylcytosine oder Alkylhalogenide) gewickelt.
Diese Funktionalitäten gezielt die mQDs spezifisch an enzymatischen Tags wie SNAP, CLIP-HALO, das genetisch mit dem interessierenden Protein fusioniert sind. Ein Protokoll für die Synthese, Targeting, und Live-Cell-Imaging von mQDs durch sterische Ausschluss produziert.
Die Modularität des MQD Design ermöglicht einen erhöhten Grad der experimentellen Flexibilität. Zum Beispiel kann eine Vielzahl von mQDs schnell in einzigartige Farben ermöglicht die gleichzeitige Darstellung von mehreren Zielen hergestellt werden. Die ssDNA-Zielsequenz können zu Proteinen mQDs lenken, Zucker 12, Lipide und Flächen 13. Eine Reihe von enzymatischen Tags sind mit orthogonaler Reaktivität, so dass mehrere Ziele gleichzeitig mit unterschiedlich gezielte mQDs abgebildet werden. Neben der Ausrichtung mit der SNAP-Tag, war auch die Kennzeichnung von Zielproteinen mit mQDs mit der CLIP-Tag, das HALO-Tag und biotinylierte Proteine erfolgreich. Dieses Protokoll zeigt die spezifische Markierung von einem Oberflächenrezeptor auf lebende Zellen mit diesen mQDs, aber das Protokoll könnte leicht zu einer Reihe von verschiedenen Kontexten angepasst werden.
Die erhebliche methodische Einblick in die Herstellung mQDs mit definierten Wertigkeit ist, dass ~ 50 Phosphorothioat- gebundenenBasen sind erforderlich, um die Quantenpunkte wickeln (und damit verhindern zwei Moleküle gleichzeitig Bindung). Eine Poly-A-S 50-Sequenz reproduzierbar und stabil gebunden 605 nm QDs von Life Technologies. Obwohl dieses Produkt wurde eingestellt, ist die sterische Ausschluss Strategie verallgemeinerbar zu ähnlichen Produkten von anderen Anbietern mit unterschiedlichen Größen, Formen, spektralen Eigenschaften.
Die Effizienz und Stabilität der ptDNA-wickelte QDs hängt entscheidend von der Oberflächenchemie und Struktur der Quantenpunkte. Daher wird der Erfolg eines Protokolls von der kommerziellen Quelle und der chemischen Struktur der Quantenpunkte abhängen. Für die Zwecke dieses Protokoll drei Hauptpunkte der Unterschied existiert zwischen verschiedenen kommerziellen Quellen QD: ein Unterschied in der Phasentransferbedingungen erforderlich; ein Unterschied in der Stärke der ersten PEG-Thiol-Liganden-Bindung, möglicherweise behindern Verschiebung der ptDNA; und ein Unterschied in der Menge des belichteten CdSe-Kern, der LEAnzeige an der Löschung der QD von der MPEG-Thiol Phasentransferbedingungen.
Wie der Veröffentlichung, QDs mit der besten Struktur für die Produktion von mQDs sind 4-10 nm CdSe / ZnS Kern / Schale-QDs von Life Technologies bei 545, 585, 605 & 625 nm (Abbildung 2A) gekauft mit Emissionsspektren. QD auf der Basis der "Klare"-Formulierung (545, 605, etc.) zu löschen bei Zugabe von mPEG Thiol und sind nicht geeignet für diese Anwendung. QDs von Aldrich und Ocean Nanotech gut funktionieren, benötigen aber mehr Phasentransferschritte und Vorbehandlung mit Trioctylphosphinoxid. Dieses Protokoll wurde für QDs von Life Technologies optimiert.
Die Poly-A-Phosphorothioat-Sequenz verwendet, um die Quantenpunkte wickeln mit einer nativen 20-mer DNA-Schwanz, der die Sequenz von (ACTG) 5, an die ein Targeting-Strang hybridisieren beendet. Diese Sequenz ist praktisch, da es wenig bis gar keine Sekundärstruktur und wird hybridiz bleibenED bei 37 ° C in PBS. Wenn es Zugang zu einem DNA-Synthesizer, kann die ptDNA synthetisiert und dann durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt, unter Verwendung eines C 8-Säule. Die ptDNA wird später auf der HPLC als gleichwertige Oligonukleotide mit einer nativen Rückgrat eluieren. Wir in der Regel verlassen die 5 'DMT-Schutzgruppe an unserer Phosphorothioatoligonukleotide nach der Reinigung.
Passivierung der ptDNA-wickelte QDs ist in der Regel, um kolloidale Stabilität der QDs zu verbessern und die Hintergrundbindung für die meisten experimentellen Anwendungen erforderlich ist. Das Protokoll verwendet eine PEG-Schicht, um die QDs zu passivieren. Carboxy PEG Alkanthiol mit zusätzlichen PEG-Einheiten ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 12 C 11 H 23 SH, Carboxy-PEG12 Alkanthiol) sieht der Hintergrund reduziert, wenn die längeren PEGs sind beide größer, und in der Regel teurer. mQDs mit Carboxy PEG Alka beschichtetne Thiolliganden sind in physiologischen Puffern sehr stabil, wie Phosphat-gepufferte Salzlösungen und Kulturmedien. Langfristigen Lagerung (> 8 Monate) von mQDs bei 4 ° C zeigte keine signifikante Aggregation oder ptDNA Ablösung 11. In Abhängigkeit von dem Versuch, PEG Passivierung der QD allein nicht immer ausreichend nicht-spezifische Bindung der mQDs reduzieren. Inkubieren sowohl Zellen und mQDs in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 3% BSA für 20 min vor dem Einsatz verringert wesentlichen nicht-spezifische Bindung an Zellen, obwohl es die scheinbare hydrodynamische Radius der mQDs von ~ 50%. Passivierung mit 0,5% Casein reduziert die nicht-spezifische Bindung noch weiter aber die scheinbare Größe in einem größeren Ausmaß als BSA erhöht.
Das 5'-Ende eines DNA-Strangs komplementär zu den mQDs kann modifiziert werden, um gezielt aus einer Anzahl von verschiedenen Biomolekülen ermöglichen. Es gibt eine Anzahl von etablierten Techniken zur Verfügung, um Proteine kovalent zu modifizieren, lipids & Zucker mit Einzelstrang-DNA (ssDNA). Solange die ssDNA extrazellulär dargestellt, ist es zugänglich löslichen mQDs. mQDs mit den vorstehenden Sequenzen schnell hybridisieren mit komplementären DNA-Strang unter Zellkulturbedingungen. Ein 10-20x Poly (CT) Abstandshalter zwischen dem ptDNA und der Targeting-Sequenz für eine effiziente Ziel erforderlich, um die Bindungssequenz über der dicken und negativ geladenen Glykokalyx der Zelle erhöhen zu sein. Aus diesem Protokoll haben wir uns für einen BG-DNA mit einer komplementären Sequenz von (CAGT) 5, die sowohl zu den mQDs hybridisiert und kovalent selbst einen Link zu einer SNAP-tag-Protein für eine schnelle und spezifische Markierung produzieren wird. Ein ähnliches Protokoll-Funktionen auch für die Kopplung anderen NHS-Ester zu Amino-modifizierte Oligonukleotide.
Für Einzelmolekülbildgebung, eine geringe Dichte der Markierung in der Regel erforderlich, um einzelne Moleküle zu lösen. Eine endgültige MQD Konzentration von ~ 0,5 nm in PBS mit Passivierungsmittelsist ein gutes Ziel. Allerdings führte unter-Markierung der Zellen diese hohen Verdünnungen manchmal. Wenn dies auftritt, können zusätzliche MQD zugegeben, bis eine optimale Dichte der Markierung beobachtet werden. Im Fall von SNAP-markierten menschlichen Notch1 Konzentrationen von> 10 nM MQD erzeugt dichte Markierung von Zellen unter 0,5 nM MQD in Folge der Anbringung ~ 20 mQDs an der Grundfläche der Zielzelle (siehe Abbildung 4b). Zellmarkierung mit mQDs war stark abhängig von der Konfluenz der Zellen plattiert. Mäßig konfluenten Zellen nicht an ihren Grundflächen zu kennzeichnen.
Zusammenfassend, ein einfaches Verfahren zur Erzeugung monovalenten und modulare QD wurde beschrieben. Diese mQDs finden in breite Palette von Live Cell Imaging-Anwendungen, wie durch Abbildung der Notch-Rezeptor auf Live-U2OS-Zellen demonstriert. Anwendbarkeit mQDs nicht auf diesen speziellen Fall beschränkt, sondern kann möglicherweise für andere zelluläre Ziele, wie andere Proteine, Nukleinsäuren und Enzymen verlängert werden.
The authors have nothing to disclose.
Finanzierung durch DOD W81XWH-1023.10.01 (ZJG), Grant P50 GM081879 von der UCSF Zentrum für Systemtechnik und Synthetische Biologie (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) und NIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ) vorgesehen ist. DS wurde von Human Frontier Science Program Greifendes Postdoc Forschungsstipendium unterstützt.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |