Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Vishal Menon; Ria Thomas; Arun R. Ghale; Christina Reinhard; Jan Pruszak

doi:10.3791/52241

JoVE Journal > Neuroscience

Neuroscience

Citometria de Fluxo protocolos para a superfície e intracelular Antigen análises de tipos de células neurais

Published: December 18, 2014

doi:

10.3791/52241

Vishal Menon, Ria Thomas², Arun R. Ghale³, Christina Reinhard, Jan Pruszak⁴

¹Emmy Noether-Group for Stem Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology,University of Freiburg, ²Spemann Graduate School of Biology and Medicine and Faculty of Biology,University of Freiburg, ³School of Life Sciences,Keele University, ⁴Center for Biological Signaling Studies (BIOSS),University of Freiburg

Summary

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Abstract

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Introduction

A citometria de fluxo foi explorado extensivamente em imunologia, hematologia e oncologia para definir populações de células através de dispersão propriedades intrínsecas, a expressão do antigénio da superfície celular, e outros parâmetros de fluorescência ^1-3. Os nossos insights sobre desenvolvimento linhagem de sangue e doença são o resultado de um significativo grau de refinamento contínuo desta metodologia após a sua implementação inicial ^{de 4,5.} O aumento da consciência do potencial analítico quantitativo e global de citometria de fluxo tem incentivado recentemente o seu uso mais difundido na pesquisa com células-tronco e pode permitir semelhante profunda progresso em um tempo mais curto ^6. No entanto, a aplicação da citometria de fluxo para analisar especificamente e isolar populações neuronais tem sido entendida como um desafio. Em contraste com as células hematopoiéticas que existem naturalmente em suspensão, os tipos de células neuronais são tipicamente colhidas de fontes excessivamente complexas que podem incluir células gliais e vários outras células circundantes, bem como uma intrincada rede de neurônios portadores de processo. Consequentemente, neurobiologia ainda tem que implementar a versatilidade de citometria de fluxo para o seu potencial completo em rotinas do cotidiano da pesquisa. No entanto, desde que uma única suspensão de células viáveis podem ser gerados (e protocolos têm sido desenvolvidos e optimizados para esse fim ^7), citometria de fluxo e de células activadas por fluorescência (FACS) pode ser considerado um elemento valioso do repertório analítico em neurobiologia ^8-11.

. Figura 1. Princípio da análise de citometria de fluxo e componentes de um citômetro de fluxo Fluxo cytometers compreendem três sistemas principais: fluídicos, óptica e eletrônica. Um fluxo simplificado de células em suspensão (preparada a partir de tecido primário ou em cultura in vitro) é realizada pela bainha Fluid através de focagem hidrodinâmica, a limitação da amostra para o seu núcleo central. As peças ópticas são compostos de lasers que iluminam o fluxo de células e os filtros ópticos que encaminham o sinal para os detectores apropriados. Os sinais de luz detectados são convertidos em sinais eletrônicos, posteriormente processadas por um computador e visualizadas em um monitor para análise de dados e gating. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Usuários de métodos de citometria de fluxo de lucro de pelo menos um conhecimento básico dos fundamentos subjacentes, incluindo blocos de construção de um citómetro (para revisão ver ^12,13; também veja a Figura 1). Um feixe de raios laser intersecta com um fluxo de fluidos hidrodinamicamente focado que contém as células em suspensão, que por sua vez, passam através do feixe de laser em um ficheiro único "um após o outro. O Interceptino de uma célula (ou qualquer outra partícula, para esse efeito) com os resultados de laser na dispersão de luz a partir deste ponto de interrogação. Luz dispersada pode ser detectada na continuação da direcção de laser (dispersão frontal, associada ao tamanho da partícula), bem como perpendiculares à sua direcção (dispersão lateral; reflectindo a granulosidade da partícula / célula). Estas propriedades de dispersão acima mencionados não exigem rotulagem específica, razão pela qual uma amostra não marcado (ou também os restos celulares, bolhas de ar, etc.) gerará um sinal (evento) na dispersão para a frente bivariada e lado dispersão comumente usado para gating inicial. Ao utilizar os lasers e filtros específicos para os espectros de excitação e de emissão correspondente adequadas, uma célula pode ser analisada quanto a sua positividade, o nível de intensidade, ou na ausência de marcadores fluorescentes. A maioria das aplicações de citometria de fluxo têm-se centrado na caracterização através de antigénios da superfície celular. Ao contrário do lineag hematopoiéticase, a linhagem neural permaneceu menos extensivamente definido de acordo com a superfície de expressão epitopo padrões ^5. Uma vantagem de explorar os antigénios de superfície é que as células vivas podem ser submetidas a triagem celular paradigmas tais como FACS. Em contraste, a coloração do antigénio intracelular requer fixação e permeabilização passos para mediar a interacção epitopo-anticorpo, o que impede a jusante aplicações que exigem células viáveis. Digno de nota, tais abordagens ainda permitem inúmeros ensaios quantitativos ^14, bem como análises a jusante para RNA e proteína expressão ^15. Hematologia, imunologia e oncologia, muitas vezes utilizado mais de uma dúzia de marcadores em conjunto para definir determinadas subpopulações ^16. Além disso, citometria de massa ou CyTOF pode agora ser utilizado para analisar se a 30 parâmetros simultaneamente ^17,18.

Para aplicações de células-tronco neurais, bem como culturas primárias ^14,19,20 A heterogeneidade das célulasvitro é um fenômeno comum ^21-23. As células não representam a população alvo de interesse encarnar um fator potencialmente confusão para leitura experimental ^24,25. Convenientemente, os diferentes tipos celulares presentes dentro de uma suspensão celular heterogénea suportar perfis de expressão de antigénio distintas (conhecidas ou ainda a ser decifrados), que podem ser utilizados para definir estes diferentes populações. A citometria de fluxo pode, portanto, desempenhar um papel crucial na resolução de heterogeneidade celular e, assim, facilitar aplicações biomédicas (ensaios in vitro, de terapia celular) e otimizar a leitura quantitativa, concentrando-se no subconjunto mais relevantes ^24,26. Várias combinações de antigénios de superfície foram identificados nos últimos anos para permitir o isolamento e quantificação de tipos de células neuronais específicas. Isto inclui CD133 para o enriquecimento de células estaminais neurais ^27, uma combinação dos / CD24 / CD29 antigénios de superfície CD15 para o isolamento da NSC, Differentiated neurônio e células da crista neural ²⁸ ou CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 para isolar neural e subconjuntos gliais ^25, entre outras assinaturas ^29,30. Além neurônios, marcadores gliais incluem A2B5 ^31, CD44 ^25, NG2 ³² e GLAST ^33. Uma publicação recente tem explorado o mesencéfalo marcador precursor floorplate CORIN ^34,35 para enriquecer precursores dopaminérgicos no transplante de células Parkinson paradigmas ^36. Moléculas de CD não são apenas marcadores, mas mediadores funcionalmente relevantes de interações célula-célula e da capacidade de uma célula para responder a estímulos a partir de moléculas de matriz extracelular e fatores de crescimento ^37. Uma estratégia de reforçar ainda mais o arsenal de antigénios CD combinatórias para caracterizar desenvolvimento da linhagem neural é a utilização de marcadores intracelulares conhecidos para rastrear e definir as combinações de antigénios CD para um tipo particular de célula de interesse. Nós exploramos recentemente essa abordagem e identificaram CD49F ^– / CD200 padrões de expressão combinatórias ^altas como uma nova abordagem para o enriquecimento de subconjuntos de neurônios de pluripotentes induzidas sistemas de cultura de células-tronco diferenciadas neurally ^38. Aqui, nós incluímos e discutir o último protocolo (e variações opcionais dos mesmos), em que a coloração da superfície e coloração intracelular pode ser utilizado simultaneamente para definir sub-populações de células neurais, por citometria de fluxo.

Figura 2. Diagrama do sistema de opções de protocolos experimentais. A figura ilustra uma representação esquemática dos principais passos envolvidos no protocolo. Passos opcionais (corante CFSE ou rotulagem antígeno intracelular) são indicados por caixas de cinza claro. Após a colheita, é essencial avaliar o número e a viabilidade de células de suspensões de células neuronais antes da coloração da superfície celular. Positivo comobem como os controlos negativos devem ser incluídos em adição às amostras de interesse. As amostras podem ser analisadas por análise de citometria de fluxo e / ou utilizadas em paradigmas de separação de células. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Embora se tenha usado previamente anticorpos primários em combinação com anticorpo secundário por ³⁸ coloração intracelular, que agora introduzir a rotulagem não-covalente do anticorpo primário através de fragmentos Fab fluorescentes (rotulagem Zenon) como uma ligeira variação, reduzindo, assim, os passos de manipulação de células ^39. Além disso, como mais um exemplo da versatilidade do protocolo, que empregam uma etiquetagem opcional de um subconjunto experimental por carboxifluoresceína éster de succinimidilo (CFSE) antes da coloração de antigénio de superfície. Essa pré-rotulagem CFSE permite a comparação direta imediata de duas linhas celulares ou condições experimentais (CFSE marcado vs. sem rótulo) dentro de um único tubo de amostra, reduzindo variação ou diferenças sutis no tempo de incubação e de poupança de anticorpos. CFSE é um corante fluorescente estabelecido que é comumente usado para rastreamento de células ^40, na proliferação ^41,42 e barcoding experiências ^43,44. Finalmente, embora passos reais (FACS, de separação de células imunomagnï¿½ica ou immunopanning) não fazem parte deste protocolo, em princípio, os procedimentos de colheita e de rotulagem descritos aqui fazer amostras de rendimento que podem ser submetidos a superfície antígeno ou aplicações de classificação baseada em rotulagem intracelulares ^{15 25,28.}

Com este artigo, pretendemos: resumir um protocolo de coloração antígeno de superfície viável ^25,28, resumir um protocolo para detecção de alvos intracelulares, bem como superfície combinada e análise do antígeno intracelular ^38, apresentar uma CFSE marcação com corante passo intracelular ^41,45 como um opção experimental para comanalisa comparativo de populações de células neurais, e resumir abordagens para análise de citometria de fluxo (controles apropriados ^13,46, gating estratégia e dados apresentação ^47).

Protocol

1. Neural colheita celular Avaliação por microscópio: Antes de iniciar um experimento, verificar o estado da cultura com brilhante-campo ou microscopia de contraste de fase. NOTA: Enquanto o tecido neural primário obtido a partir de dissecações é, em princípio, igualmente passível de análise por citometria de fluxo 14,28, por favor, note que o foco do protocolo está em células obtidas de sistemas in vitro de células neurais. Colheita de cél…

Representative Results

O protocolo aqui apresentado permite abordagens para versátil experimentais (Figura 2). Na sua versão mais curta (passos 1, 3 e 6), ele pode ser considerado como um guia para a coloração simples de antigénios de superfície. Na sua forma mais complexa, um número de paradigmas de co-marcação com uma gama de antigénios intracelulares pode ser prosseguido passos opcionais (2 e / ou 4 a 5). Além d…

Discussion

O protocolo aqui apresentado é bem estabelecido para as culturas de células neurais derivadas de células estaminais humanas, mas pode ser igualmente aplicado a outras fontes de células neurais, incluindo tecido primário ou linhas de células neuronais. Para além das fontes embrionárias, células estaminais ou progenitoras neurais pode ser extraído a partir das regiões do cérebro adulto neurogénicos ^27. Além disso, a citometria de fluxo e FACS pode ser explorada para quantificar, analisar e isolar …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the Müller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

Materials

DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Life Technologies	11330057	www.lifetechnologies.com
DPBS without Ca²⁺ Mg²⁺	Life Technologies	14190169	www.lifetechnologies.com
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)	Life Technologies	10270-106	www.lifetechnologies.com
MEM Non-essential amino acids (100 x)	Life Technologies	11140035	www.lifetechnologies.com
TrypLE Express	Life Technologies	12604013	www.lifetechnologies.com
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250061	www.lifetechnologies.com
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.3	www.carlroth.com
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001	www.gelifesciences.com
Tween-20 Detergent	Calbiochem	655205	www.merckmillipore.de
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	eBioscience	65-0850-84	www.ebioscience.com
DMSO	AppliChem	A1584	www.applichem.com
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml	Millipore	SCGPU02RE	www.millipore.com
Cell culture treated flasks (T 25)	NUNC	156367	www.thermoscientific.com
Cell culture treated flasks (T 75)	NUNC	156499	www.thermoscientific.com
Conical tubes (15 ml)	Greiner Bio-One	188271	www.greinerbioone.com
Conical tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227261	www.greinerbioone.com
Pasteur pipet, glass (150 mm)	STEIN Labortechnik, Remchingen	S03710150	www.stein-labortechnik.de
Pipet tips (0.1-10 µl)	Corning	4125	www.corning.com
Pipet tips (1-200 µl)	Corning	4126	www.corning.com
Pipet tips (100-1000 µl)	Corning	4129	www.corning.com
Serological pipets, 5 ml	Corning	4051	www.corning.com
Serological pipets, 10 ml	Corning	4101	www.corning.com
Serological pipets, 25 ml	Corning	4251	www.corning.com
Microcentrifuge tubes (0.5 ml)	Sarstedt	72,699	www.sarstedt.com
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Greiner Bio-One	616201	www.greinerbioone.com
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)	Sarstedt	72,695,500	www.sarstedt.com
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody	eBioscience	17-0247-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody	eBioscience	12-0549-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody	Covance	PRB-435P	www.covance.com Working dilution 1:2000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit	Life Technologies	A21206	www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit	Life Technologies	Z-25342	www.lifetechnologies.com

Neubauer-Improved counting chamber	Marienfeld	0640010	www.marienfeld-superior.com
Vortex	Scientific Industries	G560E	www.scientificindustries.com
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.001	www.eppendorf.com
Accuri C6 flow cytometer	Becton Dickinson (BD)	653118	www.bdbiosciences.com/instruments/accuri
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R	www.peqlab.de
Orbital shaker, Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00	www.heidolph-instruments.de
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC	Hettich	4480-50	www.hettichlab.com
Class II Biological safety cabinet Safe 2020	Thermo Scientific	51026640	www.thermoscientific.com
CO₂ Incubator, Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331	www.thermoscientific.com
Vacuum system, Vacusafe comfort	Integra Biosciences	158320	www.integra-biosciences.de
Microscope, Axiovert 40 CFL	Zeiss	451212	www.zeiss.de
Pipet controller, accu-jet pro	Brand	26303	www.brand.de
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl)	Gilson	F144563	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl)	Gilson	F144565	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl)	Gilson	F144566	www.gilson.com

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Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).