Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Vishal Menon; Ria Thomas; Arun R. Ghale; Christina Reinhard; Jan Pruszak

doi:10.3791/52241

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neuroscience

Проточной цитометрии протоколы для поверхностных и внутриклеточных антиген анализ нейронных типов клеток

Published: December 18, 2014

doi:

10.3791/52241

Vishal Menon, Ria Thomas², Arun R. Ghale³, Christina Reinhard, Jan Pruszak⁴

¹Emmy Noether-Group for Stem Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology,University of Freiburg, ²Spemann Graduate School of Biology and Medicine and Faculty of Biology,University of Freiburg, ³School of Life Sciences,Keele University, ⁴Center for Biological Signaling Studies (BIOSS),University of Freiburg

Summary

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Abstract

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Introduction

Проточной цитометрии была широко использована в иммунологии, гематологии и онкологии для определения клеточных популяций с помощью внутренних свойств рассеяния, экспрессии антигенов на клеточной поверхности, и других параметров флуоресценции ^1-3. Наши идеи в развитие родословия и болезни являются результатом в значительной степени непрерывного уточнения этой методологии после ее первоначального ^4,5 реализации. Повышение осведомленности о количественном и в целом аналитический потенциал проточной цитометрии недавно призвал к его более широкое применение в исследованиях стволовых клеток и может позволить так же глубокое прогресса в более короткие сроки ^6. Тем не менее, применение проточной цитометрии конкретно анализировать и изолировать нейронных популяций уже давно воспринимается как сложной. В отличие от гемопоэтических клеток, что, естественно, существует в виде суспензии, нейронные клеточные типы, как правило, собирают из чрезмерно сложных источников, которые могут включать в себя глии и различные OРОЧИЕ окружающие клетки, а также сложная сеть технологических несущих нейронов. Следовательно, нейробиологии еще реализовать универсальность проточной цитометрии до его полного потенциала в повседневной исследовательских процедур. Тем не менее, до тех пор, жизнеспособным суспензии отдельных клеток могут быть созданы (и протоколы были разработаны и оптимизированы для этой цели ^7), проточной цитометрии и флуоресценции активированных сортировки клеток (FACS) можно считать ценным элементом аналитического репертуара в нейробиологии ^8-11.

. Рисунок 1. Принцип анализа проточной цитометрии и компонентов проточной цитометрии потока цитометры включает в себя три основные системы: струйная, оптики и электроники. Упорядочить поток клеток в суспензии (полученного из первичной ткани или в пробирке культуры) осуществляется оболочки Флуиd помощью гидродинамической фокусировки, ограничивая образца к его центру ядра. Оптические части состоят из лазеров, которые освещают поток клеток и оптических фильтров, которые направляют сигнал на соответствующие детекторы. Световые сигналы, обнаруженные преобразуются в электрические сигналы, затем обрабатываются на компьютере и визуализированных на мониторе для анализа данных и стробирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Пользователи расхода методы цитометрические прибыли из, по меньшей мере, базовое понимание основных фундаментальных том числе строительных блоков цитометром (для обзора см ^12,13; также рисунок 1). Лазерный луч пересекается с гидродинамически сосредоточены жидкостного потока, который содержит клетки в суспензии, которая, в свою очередь проходят через лазерный луч в «одном файле" один за другим. Interceptiна клетки (или любой другой частицы, если на то пошло) с лазерными результатов в рассеянии света с этой точки допроса. Рассеянный свет может быть обнаружен в продолжение лазерного направлении (вперед разброс, связанный с размером частиц), а также перпендикулярно к ее стороной (разброса; отражающий зернистости частицы / клетки). Эти вышеупомянутые свойства рассеяния не требует специального маркировки, поэтому немеченый образец (или также продукты распада клеток, пузырьки воздуха, и т.д.) будет генерировать сигнал (событие) на двумерной рассеяния вперед по сравнению с боковой разброс участка обычно используется для начальной селекции. С помощью соответствующих лазеров и фильтры, специфичных для соответствующего спектров возбуждения и испускания, клетки могут быть проанализированы для его положительности, уровень интенсивности, или отсутствие флуоресцентных маркеров. Большинство приложений цитометрии потока были сосредоточены на характеристики с помощью антигенов клеточной поверхности. В отличие от гемопоэтических lineagе, нейронная линия осталась менее широко определяется в соответствии с поверхности профилей экспрессии эпитоп ^5. Одним из преимуществ использования поверхностных антигенов в том, что живые клетки могут быть подвергнуты сортировки клеток парадигмы, такие как FACS. В отличие от этого, внутриклеточное окрашивание антиген требуется фиксация и пермеабилизирующего шаги, чтобы посредничать эпитоп-антитело взаимодействия, исключающие вниз по течению приложений, которые требуют жизнеспособных клеток. Следует отметить, что такие подходы по-прежнему обеспечивают многочисленные количественных анализов ^14, а также вниз по течению анализов РНК и белка выражение ^15. Гематология, иммунология и онкология часто используется более чем десятка маркеры в сочетании, чтобы определить конкретные субпопуляции ^16. Кроме того, масса цитометрии или CyTOF теперь могут быть использованы для анализа до 30 параметров одновременно ^17,18.

Для применений нейронных стволовых клеток, а также в первичных культурах ^14,19,20 гетерогенности клеток впробирке является распространенным явлением ^21-23. Клетки не представляющие целевую популяцию интерес воплотить потенциально сбивающий фактор экспериментального считывания ^24,25. Удобно, различные клеточные подмножества, присутствующие в гетерогенной суспензии клеток несут различные (известные или еще не расшифрованы) профили экспрессии антигена, которые могут быть использованы, чтобы определить эти различные группы населения. Проточной цитометрии, следовательно, могут сыграть решающую роль в урегулировании сотовой неоднородность и, следовательно, способствовать биомедицинских приложений (анализы в пробирке, клеточной терапии) и оптимизировать количественный отсчет, сосредоточив внимание на наиболее значимой подмножества ^24,26. Различные комбинации поверхностного антигена были определены в течение последних нескольких лет, чтобы позволить количественное и выделение специфических нейронных типов клеток. Это включает в себя CD133 для обогащения нервных стволовых клеток ^27, сочетание CD15 / CD24 / CD29 поверхностных антигенов для выделения НСК, отличительноеТед нейрон и клетки нервного гребня ²⁸ или CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271, чтобы изолировать нервных и глиальных подмножества ^25, среди других подписей ^29,30. Помимо нейронов, глиальных маркеры включают A2B5 ^31, CD44 ^25, NG2 ³² и Glast ^33. Недавняя публикация эксплуатировал среднего мозга донной маркер предшественника Корин ^34,35 обогащать дофаминергических прекурсоров в трансплантации Паркинсона клеток парадигм ^36. Молекулы CD не только маркеры, но функционально соответствующие медиаторы межклеточных взаимодействий и способности клеток к реагируют на сигналы от молекул внеклеточного матрикса и факторов роста ^37. Одна из стратегий дальнейшего повышения арсенал комбинаторных CD антигенов охарактеризовать развитие нейронального происхождения является использование известных внутриклеточных маркеров для скрининга и определить комбинации CD-антиген для конкретного типа клеток, представляющих интерес. Мы недавно эксплуатируются такой подход и определил CD49F ^– / CD200 ^{высокие} комбинаторные паттерны экспрессии в качестве нового подхода к обогащению нейронов подмножества из ЦНС дифференцированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток культуры систем ^38. Здесь мы включаем и обсуждать последний протокол (и дополнительные варианты таковых), в котором поверхность окрашивание и внутриклеточное окрашивание может быть использован одновременно для определения нейронных субпопуляций клеток с помощью проточной цитометрии.

Рисунок 2. Блок-схема экспериментальной вариантов протокола. Рисунок изображает схематическое представление основных этапов в протоколе. Дополнительные шаги (CFSE краситель или внутриклеточная антиген маркировка) обозначены светло-серых коробок. После сбора важно, чтобы оценить жизнеспособность клеток и количество нейронных клеточных суспензий предшествующих окрашивания клеточной поверхности. Как положительные,также должны быть включены в дополнение к образцам, представляющим интерес отрицательные контроли. Образцы могут быть проанализированы с помощью анализа проточной цитометрии и / или используются в сотовых сортировки парадигм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

В то время как мы уже использовали первичное антитело в сочетании с вторичным антителом для внутриклеточного окрашивания ^38, теперь ввести нековалентную маркировки первичного антитела с помощью флуоресцентных Fab фрагментов (Зенон маркировка), как небольшое изменение, тем самым уменьшая этапы клеток манипуляции ^39. Кроме того, в качестве дополнительного примера универсальности этого протокола, мы используем дополнительный маркировки одной экспериментальной подгруппе по карбоксифлуоресцеина сукцинимидилпальмитата эфир (CFSE) до поверхности окрашивание антиген. Такое CFSE предварительно маркировка позволяет немедленно прямое сравнение двух клеточных линий или экспериментальных условиях (CFSE меченных против. немеченый) в пределах одного образца трубы, снижая дисперсию или тонкие различия во времени инкубации и экономии антитела. CFSE является признанным флуоресцентный краситель, который обычно используется для отслеживания ⁴⁰ клеток, пролиферации в ^41,42 и ^43,44 штрих кода экспериментов. Наконец, в то время как реальные шаги для сортировки (FACS, разделение иммуномагнитный клетка или immunopanning) не являются частью данного протокола, в принципе, процедуры сбора урожая и маркировки описанные здесь образцы урожая, которые могут быть подвергнуты поверхностной антиген или внутриклеточные маркировки на основе сортировки приложений ^{15 25,28.}

В этой статье мы стремимся: обобщить жизнеспособным поверхности окрашивания антигена протокол ^25,28, обобщить протокол для обнаружения внутриклеточных мишеней, а также в сочетании поверхностных и внутриклеточных анализ антигена ^38, представить внутриклеточный CFSE маркировки краситель шаг ^41,45 в экспериментальная опция для COMсравнительный анализ нейронных популяций клеток, и обобщить подходы к анализ течения цитометрический (соответствующие элементы управления ^13,46, воротные стратегии и представление данных ^47).

Protocol

1. нервных клеток урожая Оценка микроскопом: До начала эксперимента, проверки состояния культуры с ярко-поле или фазово-контрастной микроскопии. ПРИМЕЧАНИЕ: При первичной нервной ткани, полученной от вскрытия, в принципе, одинаково поддаются проточной цитометрии анализ <…

Representative Results

Протокол, представленные здесь позволяет универсальный экспериментальных подходов (Рисунок 2). В своем сжатые версии (шаги 1, 3 и 6), можно считать, руководство для простого окрашивания поверхностных антигенов. В более сложной форме, количество со-маркировки па…

Discussion

Протокол, представленные здесь, хорошо известна в культурах нервных клеток, полученных из человеческих стволовых клеток, но может быть в равной степени применено к другим нейронных клеточных источников в том числе первичной ткани или нейронных клеточных линий. В дополнение к эмбриона…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the Müller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

Materials

DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Life Technologies	11330057	www.lifetechnologies.com
DPBS without Ca²⁺ Mg²⁺	Life Technologies	14190169	www.lifetechnologies.com
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)	Life Technologies	10270-106	www.lifetechnologies.com
MEM Non-essential amino acids (100 x)	Life Technologies	11140035	www.lifetechnologies.com
TrypLE Express	Life Technologies	12604013	www.lifetechnologies.com
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250061	www.lifetechnologies.com
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.3	www.carlroth.com
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001	www.gelifesciences.com
Tween-20 Detergent	Calbiochem	655205	www.merckmillipore.de
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	eBioscience	65-0850-84	www.ebioscience.com
DMSO	AppliChem	A1584	www.applichem.com
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml	Millipore	SCGPU02RE	www.millipore.com
Cell culture treated flasks (T 25)	NUNC	156367	www.thermoscientific.com
Cell culture treated flasks (T 75)	NUNC	156499	www.thermoscientific.com
Conical tubes (15 ml)	Greiner Bio-One	188271	www.greinerbioone.com
Conical tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227261	www.greinerbioone.com
Pasteur pipet, glass (150 mm)	STEIN Labortechnik, Remchingen	S03710150	www.stein-labortechnik.de
Pipet tips (0.1-10 µl)	Corning	4125	www.corning.com
Pipet tips (1-200 µl)	Corning	4126	www.corning.com
Pipet tips (100-1000 µl)	Corning	4129	www.corning.com
Serological pipets, 5 ml	Corning	4051	www.corning.com
Serological pipets, 10 ml	Corning	4101	www.corning.com
Serological pipets, 25 ml	Corning	4251	www.corning.com
Microcentrifuge tubes (0.5 ml)	Sarstedt	72,699	www.sarstedt.com
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Greiner Bio-One	616201	www.greinerbioone.com
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)	Sarstedt	72,695,500	www.sarstedt.com
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody	eBioscience	17-0247-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody	eBioscience	12-0549-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody	Covance	PRB-435P	www.covance.com Working dilution 1:2000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit	Life Technologies	A21206	www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit	Life Technologies	Z-25342	www.lifetechnologies.com

Neubauer-Improved counting chamber	Marienfeld	0640010	www.marienfeld-superior.com
Vortex	Scientific Industries	G560E	www.scientificindustries.com
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.001	www.eppendorf.com
Accuri C6 flow cytometer	Becton Dickinson (BD)	653118	www.bdbiosciences.com/instruments/accuri
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R	www.peqlab.de
Orbital shaker, Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00	www.heidolph-instruments.de
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC	Hettich	4480-50	www.hettichlab.com
Class II Biological safety cabinet Safe 2020	Thermo Scientific	51026640	www.thermoscientific.com
CO₂ Incubator, Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331	www.thermoscientific.com
Vacuum system, Vacusafe comfort	Integra Biosciences	158320	www.integra-biosciences.de
Microscope, Axiovert 40 CFL	Zeiss	451212	www.zeiss.de
Pipet controller, accu-jet pro	Brand	26303	www.brand.de
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl)	Gilson	F144563	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl)	Gilson	F144565	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl)	Gilson	F144566	www.gilson.com

References

Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods (San Diego, Calif). 57 (3), 251-258 (2012).
Jaye, D. L., Bray, R. A., Gebel, H. M., Harris, W. A. C., Waller, E. K. Translational applications of flow cytometry in clinical practice). J. Immunol. 188 (10), 4715-4719 (2012).
Henel, G., Schmitz, J. Basic Theory and Clinical Applications of Flow Cytometry. Lab Med. 38 (7), 428-436 (2007).
Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2 (6), 640-653 (2010).
Ulrich, H., Bocsi, J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry. A. 77 (1), 6-10 (2010).
Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
Meyer, R. A., Zaruba, M. E., McKhann, G. M. Flow cytometry of isolated cells from the brain. Anal. Quant. Cytol. 2 (1), 66-74 (1980).
Junger, H., Junger, W. G. CNTF and GDNF, but not NT-4, support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms. Neuroreport. 9 (16), 3749-3754 (1998).
McLaren, F. H., Svendsen, C. N., Vander Meide, P., Joly, E. Analysis of neural stem cells by flow cytometry: cellular differentiation modifies patterns of MHC expression. J. Neuroimmunol. 112 (1-2), 35-46 (2001).
Wang, S., Roy, N. S., Benraiss, A., Goldman, S. A. Promoter-based isolation and fluorescence-activated sorting of mitotic neuronal progenitor cells from the adult mammalian ependymal/subependymal. 22 (1-2), 167-176 (2000).
Tanke, H. J., vander Keur, M. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting. Trends Biotechnol. 11 (2), 55-62 (1993).
Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. J. Neurosci. Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
Ernst, A., et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell. 156 (5), 1072-1083 (2014).
Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
Bandura, D. R., et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (16), 6813-6822 (2009).
Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
Neveu, I., Rémy, S., Naveilhan, P. The neuropeptide Y receptors, Y1 and Y2, are transiently and differentially expressed in the developing cerebellum. Neuroscience. 113 (4), 767-777 (2002).
Pruszak, J., Just, L., Isacson, O., Nikkhah, G. Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2 (Unit 2D.5), (2009).
Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14506-14511 (2002).
Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993 (1-2), 18-29 (2003).
Pruszak, J., Isacson, O. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy. Adv. Exp. Med. Biol. 651, 112-123 (2009).
Carson, C. T., Aigner, S., Gage, F. H. Stem cells: the good, bad and barely in control. Nat. Med. 12 (11), 1237-1238 (2006).
Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PloS One. 6 (3), e17540 (2011).
Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat. Med. 12 (11), 1259-1268 (2006).
Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (26), 14720-14725 (2000).
Pruszak, J., Ludwig, W., Blak, A., Alavian, K., Isacson, O. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells. Stem Cells. 27 (12), 2928-2940 (2009).
Peh, G. S. -. L., Lang, R. J., Pera, M. F., Hawes, S. M. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation. Stem Cells Dev. 18 (2), 269-282 (2009).
Golebiewska, A., Atkinson, S. P., Lako, M., Armstrong, L. Epigenetic landscaping during hESC differentiation to neural cells. Stem Cells. 27 (6), 1298-1308 (2009).
Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40 (1), 65-77 (2002).
Nishiyama, A. NG2 cells in the brain: a novel glial cell population. Hum. Cell. 14 (1), 77-82 (2001).
Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60 (6), 894-907 (2012).
Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
Chung, S., et al. ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (23), 9703-9708 (2011).
Doi, D., et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
Solozobova, V., Wyvekens, N., Pruszak, J. Lessons from the embryonic neural stem cell niche for neural lineage differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8 (3), (2012).
Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PloS One. 8 (6), e68519 (2013).
Buchwalow, I. B., Böcker, W. Chapter 2. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 9-17 (2010).
Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287 (2012).
Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J. Vis. Exp. 44, (2010).
Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PloS One. 8 (1), e53015 (2013).
Jiang, L., et al. Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells. The J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 140, 90-99 (2014).
Hulspas, R., et al. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry. B. 76 (6), 355-364 (2009).
Moloney, M., Shreffler, W. G. Basic science for the practicing physician: flow cytometry and cell sorting. Annals of Allergy, Asthm., & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma., & Immunology. 101 (5), 544-549 (2008).
Siebzehnrubl, F. A., et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells. Methods Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain). J. Neurosci. Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
Tham, C. -. S., Lin, F. -. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. Int. J. Dev. Neurosci. 21 (8), 431-443 (2003).
Nguyen, H. X., Beck, K. D., Anderson, A. J. Quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry: a novel use for a cell purification method. J. Vis. Exp. (50), e2698 (2011).
Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), 262 (2007).
Brunlid, G., Pruszak, J., Holmes, B., Isacson, O., Sonntag, K. C. Immature and neurally differentiated mouse embryonic stem cells do not express a functional Fas/Fas ligand system. Stem Cells. 25 (10), 2551-2558 (2007).
Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71 (2), 143-155 (1997).
Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
Nielsen, J. A., Maric, D., Lau, P., Barker, J. L., Hudson, L. D. Identification of a novel oligodendrocyte cell adhesion protein using gene expression profiling. J. Neurosci. 26 (39), 9881-9891 (2006).
Daneman, R., et al. The mouse blood-brain barrier transcriptome: a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells. PloS One. 5 (10), e13741 (2010).
Gräbner, R., Till, U., Heller, R. Flow cytometric determination of E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1, and intercellular cell adhesion molecule-1 in formaldehyde-fixed endothelial cell monolayers. Cytometry. 40 (3), 238-244 (2000).
Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
Lathia, J. D., et al. High-throughput flow cytometry screening reveals a role for junctional adhesion molecule a as a cancer stem cell maintenance factor. Cell Rep. 6 (1), 117-129 (2014).
Ganat, Y. M., et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment. J. Clin. Invest. 122 (8), 2928-2939 (2012).
Hedlund, E., et al. Embryonic stem cell-derived Pitx3-enhanced green fluorescent protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by fluorescence-activated cell sorting and function in an animal model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 26 (6), 1526-1536 (2008).
Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
Chivet, M., Hemming, F., Pernet-Gallay, K., Fraboulet, S., Sadoul, R. Emerging role of neuronal exosomes in the central nervous system. Front. Physiol. 3, 145 (2012).
Graner, M. W., et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J. 23 (5), 1541-1557 (2009).
Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
Nieoullon, V., Belvindrah, R., Rougon, G., Chazal, G. mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol. Cell. Neurosci. 28 (3), 462-474 (2005).
Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., French-Constant, C. Integrins are markers of human neural stem cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
Hargus, G., et al. Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (36), 15921-15926 (2010).
Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).