Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)
Summary
I livelli di proteine nelle cellule e tessuti sono spesso strettamente regolati dal saldo della produzione di proteine e di liquidazione. Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), la cinetica di clearance di proteine possono essere sperimentalmente misurati in vivo.
Abstract
Stabilità della proteina influenza molti aspetti della biologia, e misurando la cinetica di clearance di proteine in grado di fornire importanti informazioni nei sistemi biologici. In esperimenti FDAP, la clearance di proteine negli organismi viventi può essere misurata. Una proteina di interesse è etichettato con una proteina fluorescente fotoconvertibile, espresso in vivo e photoconverted, e la diminuzione del segnale di photoconverted nel tempo è monitorato. I dati vengono poi dotata di un modello di clearance appropriato per determinare la proteina emivita. È importante sottolineare che la cinetica di clearance delle popolazioni di proteine in diversi comparti dell'organismo possono essere esaminati separatamente applicando maschere compartimentali. Questo approccio è stato utilizzato per determinare l'emivita intra- ed extracellulari di proteine di segnalazione secrete durante lo sviluppo zebrafish. Qui, descriviamo un protocollo per la sperimentazione FDAP in embrioni di zebrafish. Dovrebbe essere possibile utilizzare FDAP per determinare la cinetica di liquidazioneogni proteina oggetto di tag in ogni organismo otticamente accessibile.
Introduction
I livelli di proteine nelle cellule ed organismi sono determinati dalla loro tassi di produzione e passaggio. Protein dimezzamento possono variare da minuti a giorni 1-4. In molti sistemi biologici, la stabilizzazione o liquidazione di proteine chiave ha effetti importanti sulla attività cellulare. È necessaria modulazione di stabilità proteina intracellulare per la progressione del ciclo cellulare 5,6, segnalazione di sviluppo 7-9, apoptosi 10, e la funzione normale e la manutenzione dei neuroni 11,12. Stabilità della proteina extracellulare influenza la distribuzione e la disponibilità di proteine secrete, come morphogens 13,14, all'interno di un tessuto.
Negli ultimi decenni, la stabilità della proteina è stata valutata principalmente in coltura cellulare utilizzando radioattivo pulse-etichettatura o esperimenti chase cicloesimide 15. In tali esperimenti pulse-chase, le cellule sono o transitoriamente esposti ad un "impulso" di amino radioattiviprecursori di acidi che sono incorporati in proteine di nuova sintesi, o sono esposti a cicloesimide, che inibisce la sintesi proteica. Cellule coltivate vengono poi raccolti in diversi momenti, e sia immunoprecipitazione seguita da autoradiografia (in radioattive esperimenti pulse-chase) o occidentale assorbente (in esperimenti cicloesimide) viene utilizzato per quantificare il gioco di proteine nel corso del tempo.
Test di stabilità proteica convenzionali hanno diverse lacune. Innanzitutto, proteine in questi saggi sono spesso non espressi in loro ambienti endogeni, ma piuttosto in coltura tissutale e talvolta in cellule di specie diverse. Per proteine la cui stabilità è dipendente dal contesto, questo approccio è problematico. In secondo luogo, non è possibile seguire la clearance proteine in singole cellule o organismi nel tempo, ed i dati da questi saggi riflette una media delle diverse popolazioni di cellule a tempi diversi. Poiché le cellule individuali possono avere iniziatocon diverse quantità di proteine, potrebbe aver preso l'etichetta o cicloesimmide radioattivo in tempi diversi, o può avere diverse cinetiche di liquidazione, tali dati aggregati potrebbero essere fuorvianti. Infine, nel caso di esperimenti chase cicloeximide, aggiunta del inibitore della sintesi proteica può avere effetti fisiologici indesiderati che potrebbero alterare artificialmente stabilità proteica 16-18. Queste carenze possono essere evitati utilizzando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), una tecnica che utilizza le proteine fotoconvertibile per misurare il gioco di proteine in modo dinamico in organismi viventi 19-25 (vedi la discussione per le limitazioni della tecnica FDAP).
Proteine fotoconvertibile sono proteine fluorescenti la cui eccitazione e di emissione di proprietà cambiare dopo l'esposizione a specifiche lunghezze d'onda della luce 26. Una variante comunemente usata è Dendra2, una proteina fotoconvertibile "green-to-rossa", che ha inizialmente excitazioni ed emissione proprietà simili alle proteine fluorescenti verdi, ma dopo l'esposizione a "fotoconversione" UV light- -il eccitazione / proprietà di emissione diventano simili a quelle delle proteine fluorescenti rosse 23,27. È importante sottolineare che, nuova proteina prodotta dopo fotoconversione non avrà le stesse proprietà di eccitazione / emissione come la proteina photoconverted, permettendo disaccoppiamento della produzione e la clearance su fotoconversione e l'osservazione di solo un pool di proteine photoconverted. Tagging proteine di interesse con le proteine fotoconvertibile fornisce quindi un modo conveniente per impulsi-label proteine intatte, organismi viventi otticamente accessibili.
In saggi FDAP (Figura 1A), una proteina di interesse è etichettato con una proteina fotoconvertibile ed espressa in un organismo vivente (Figura 1B). La proteina di fusione è photoconverted, e la diminuzione del segnale photoconverted nel tempo è monitorato da fluorescenmicroscopia ce (Figura 1C). I dati vengono poi dotato di un modello appropriato per determinare l'emivita della proteina di fusione (Figura 1D).
Il test FDAP qui descritto è stato progettato per determinare l'emivita extracellulari di proteine di segnalazione secrete in embrioni di zebrafish durante la prima embriogenesi 19. Tuttavia, questo approccio può essere adattato a qualsiasi organismo modello trasparente che tollera imaging dal vivo, e potrebbe essere usato per monitorare il passaggio di qualsiasi proteina intracellulare o extracellulare oggetto di tag. Variazioni della tecnica qui descritta sono stati effettuati in cellule in coltura 20,23 e 22 Drosophila e topo di 21 embrioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il successo di un esperimento FDAP si basa sulla generazione di una proteina di fusione fotoconvertibile funzionale. Tagging una proteina può compromettere la sua attività biologica e / o proprietà biofisiche, tra cui la sua localizzazione, solubilità, stabilità e 36-41. Siate pronti a testare l'attività di diversi costrutti di fusione diversi al fine di trovare uno che è attiva. Abbiamo trovato che la modifica della posizione della proteina fotoconvertibile relativa alla proteina di interesse o ut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Jeffrey Farrell, James Gagnon, e Jennifer Bergmann per i commenti sul manoscritto. KWR è stato sostenuto dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program durante lo sviluppo del test FDAP. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH di AFS e da finanziamenti della Fondazione tedesca per la ricerca (Emmy Noether Program), il Max Planck Society, e il Programma Umana Frontier Science (Career Development Award) per PM.
Materials
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) | To generate capped mRNA for injection into embryos | ||
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks | ||
| 6-well plastic dish (BD Falcon) | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | ||
| Embryo medium | 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage | ||
| 5 cm diameter glass petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use | ||
| Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos | ||
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 | ||
| 15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | ||
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25x or 40x water objective | Objective for imaging | ||
| 10x air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
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