Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)
Summary
Hücre ve dokularda protein seviyeleri, çoğu zaman sıkı bir şekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Fotoçevrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kinetiği deneysel in vivo olarak ölçülebilir.
Abstract
Protein istikrar biyoloji birçok açıdan etkiler ve proteinlerin temizlenmesi kinetik ölçüm biyolojik sistemlere önemli bilgiler sağlayabilir. FDAP deneylerde, canlı organizmalar içinde protein açıklık ölçülebilir. İlgi dahilindeki bir proteini, photoconvertible floresan protein with in vivo ifade photoconverted ve zaman içinde photoconverted sinyal azalması takip edilir. Veriler daha sonra, protein yarı ömrünü tayin etmek için uygun bir açıklık modeli ile donatılmıştır. Önemlisi, organizmanın farklı bölümlerinde protein popülasyonlarının açıklık kinetiği bölmeli maskeleri uygulayarak ayrı ayrı muayene edilebilir. Bu yaklaşım, zebra balığı gelişimi esnasında salgılanan sinyal proteinleri ve hücre içi ve hücre dışı yarılanma ömürlerine belirlemek için kullanılmıştır. Burada, biz Zebra balığı embriyolar FDAP deneyler için bir protokol açıklar. Bu klirensi kinetiklerini belirlemek için FDAP kullanmak mümkün olmalıdırherhangi bir optik olarak erişilebilir bir organizmada bir taggable proteini.
Introduction
hücre ve organizmalardaki protein seviyeleri, üretim ve klirens oranlarına göre belirlenmektedir. Protein yarı ömürleri dakika gün 1-4 aralığında olabilir. Birçok biyolojik sistemlerde, anahtar proteinlerin stabilizasyonu veya açıklık hücresel aktivite üzerinde önemli etkileri vardır. Hücre içi protein stabilitesi modülasyonu, hücre döngüsü ilerlemesinin 5,6, gelişim sinyal 7-9 apoptoz 10 ve normal fonksiyon ve nöronların 11,12 ettirilmesi için gereklidir. Hücre dışı protein kararlılığı bir doku içinde dağılımı ve morphogens 13,14 olarak salgılanan proteinler, kullanılabilirliğini etkiler.
Son birkaç yıldır, protein stabilitesi esas radyoaktif darbe-etiketleme ya da sikloheksimid kovalamaca deneyleri 15 kullanılarak hücre kültüründe değerlendirilmiştir. Böyle darbe kovalayıcı deneyler, hücreler ya da geçici olarak bir radyoaktif amino "darbe" maruzasit ön-maddeleri, yeni sentezlenmiş olan proteinlerle birleştirilmiştir, ya da protein sentezini inhibe sikloheksimid, maruz kaldığı. Kültürlenmiş hücreler, daha sonra farklı zaman noktalarında toplanır, ve ya (radyoaktif darbe kovalayıcı deneyler) otoradyografi ile takip immüno ya da (sikloheksimid deneylerinde) batı beneklemesinden zaman içinde protein açıklık ölçmek için kullanılır.
Konvansiyonel protein stabilitesi deneyleri bazı eksiklikleri vardır. İlk olarak, bu deneylerde proteinler genellikle endojen ortamlarda ifade edilmez, bunun yerine farklı türlerden elde edilen hücreler, doku kültürü içinde, bazen de. Stabiliteleri bağlam-bağımlı proteinleri için, bu yaklaşım sorunludur. İkinci olarak, zaman içinde tek tek hücreler ya da organizmalar protein açıklık takip etmek mümkün değildir, ve bu deneylerde elde edilen veriler, farklı zaman noktalarında farklı hücre popülasyonlarının ortalamasıdır. Tek tek hücreler başlamış olabilir bu yanaproteinin farklı miktarlarda farklı zamanlarda radyoaktif etiket ya da sikloheksimid almış olabilir, ya da farklı açıklık kinetiği, örneğin toplam veri yanıltıcı olabilecek olabilir. Son olarak, sikloheksimid takip deneylerinde durumunda, protein sentez önleyicisi ilave yapay protein kararlılığının 16-18 değiştirebilir istenmeyen fizyolojik etkilere sahip olabilir. Bu eksiklikler, Fotoçevrim (FDAP) sonra photoconvertible proteinler Organizma 19-25 canlı dinamik proteini açıklığını ölçmek için kullanan bir teknik Floresan Bozunma kullanılarak önlenebilir (FDAP teknik sınırlamaları için bölümüne bakınız).
Photoconvertible proteinler olan uyarma ve emisyon özellikleri hafif 26 özel dalga boylarına maruz kaldıktan sonra değiştirmek floresan proteinleri vardır. Genel olarak kullanılan bir varyant Dendra2 başlangıçta eski bir "yeşil için kırmızı" photoconvertible proteindiratıf ve emisyon yeşil floresan protein benzer özellikler, fakat UV ışık "Fotoçevrim" maruz kaldıktan sonra uyarma-onun / emisyon özellikleri kırmızı flüoresan protein 23,27 benzer hale gelir. Daha da önemlisi, Fotoçevrim sonra üretilen yeni bir protein photoconverted proteinin sadece bir havuz Fotoçevrim üzerine üretimi ve temizlenmesi ayrılmasına ve gözlem izin photoconverted protein ile aynı uyarım / emisyon özellikleri sahip olmayacaktır. Photoconvertible proteinleri ile ilgi proteinleri Etiketleme ve böylece darbe-etiket için sağlam, optik erişilebilir canlılarla proteinleri uygun bir yol sağlar.
FDAP deneyleri (Şekil 1A) 'de, ilgi konusu bir protein photoconvertible protein ile etiketlenir ve bir canlı organizmada (Şekil 1B) olarak ifade edilmiştir. Füzyon proteini photoconverted edilir ve zaman içinde photoconverted sinyal azalması flüoresan ile izlenirce mikroskobu (Şekil 1C). Veriler daha sonra füzyon proteininin (Şekil 1D) yarı ömrünü tayin etmek için uygun bir model ile donatılmıştır.
Burada anlatılan FDAP tahlil erken embriyogenez 19 döneminde Zebra balığı embriyolarının salgılanan sinyal proteinlerin hücre dışı yarım hayatlarını belirlemek için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, canlı görüntüleme tolere eder ve herhangi bir taggable hücre içi ya da hücre dışı proteinin açıklık izlemek için kullanılabilecek herhangi bir şeffaf model organizma için adapte edilebilir. Burada tarif edilen tekniğin varyasyonları kültürlenmiş hücreler 20,23 ve Drosophila 22 ve fare 21 embriyo olarak yapılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir FDAP deney başarısı fonksiyonel photoconvertible füzyon proteininin üretimi dayanır. Bir protein etiketleme onun biyolojik aktivitesini ve / veya yerleşim yeri, çözünürlük ve stabilite 36-41 dahil olmak üzere biyo-fiziksel özelliklerini etkileyebilir. Aktif aktiviteleri için çok sayıda farklı füzyon yapılarının aktivitesi test etmek için hazırlanabilir. Bunun ötesinde ilgili protein için photoconvertible proteini göre konumunu değiştirmek veya daha fazla bağlayıcılar ile <e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar yazının yorumları için Jeffrey Farrell, James Gagnon, ve Jennifer Bergmann teşekkür etmek istiyorum. KWR FDAP testinin geliştirilmesi sırasında Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu Programı tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma AFS NIH hibe yoluyla ve Alman Araştırma Vakfı (Emmy Noether Programı), Max Planck Kurumu ve PM İnsan Frontier Bilim Programı (Kariyer Geliştirme Ödülü) hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) | To generate capped mRNA for injection into embryos | ||
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks | ||
| 6-well plastic dish (BD Falcon) | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | ||
| Embryo medium | 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage | ||
| 5 cm diameter glass petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use | ||
| Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos | ||
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 | ||
| 15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | ||
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25x or 40x water objective | Objective for imaging | ||
| 10x air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
- Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O’Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Parry, D. H., O’Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
- Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
- Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
- MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
- Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
- Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -. Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
- Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
- Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
- Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
- Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
- Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
- Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
- Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
- Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
- Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
- Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
- Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
- Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
- Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
- Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
- Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
- Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
- Bläßle, A., Müller, P. . PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, (2014).
