En mus Føtal Skin Model af scarless sårheling

Summary

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Abstract

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Introduction

Føtal hud sår heler hurtigt, og scarlessly indtil sent i drægtighedsperioden ^1. Føtal scarless sårheling er kendetegnet ved regenerering af normalt væv arkitektur og funktion. Overgangen fra en scarless til ardannelse fænotype forekommer i tredje trimester af graviditeten hos mennesker og omkring fosterdag 18 (E18) i mus ^2,3. I forhold til voksne, er føtal sår reparation præget af hurtig epitelialisering, bindevæv aflejring, og fibroblast migration.

Mange undersøgelser har tilbudt mulige forklaringer på fænomenet scarless sårheling i den tidlige fosterudvikling. Inflammation er et grundlæggende element i voksne sår reparation; imidlertid føtale sår er kendetegnet ved en mangel på akut inflammation ^4. Hvorvidt dette er en følge af den funktionelle umodenhed af immunsystemet under føtale stadier forbliver uklar. En nylig undersøgelse foreslog, at forskelle i overflod, maturity, og funktion af mastceller i E15 vs E18 føtal hud kan være ansvarlig for overgangen fra en scarless fænotype, i hvert fald i musen ^3. Andre undersøgelser postulere, at forskelle i egenskaber og overflod af føtale og voksne sår makrofager er ansvarlige for reformation af normal ekstracellulær matrix (ECM) under føtal sårheling ^5.

Forskelle i miljøfaktorer under føtal og voksen udvikling kan også påvirke sårheling. Longaker og kolleger har vist, at sårvæske fra fosteret besidder høje niveauer af hyaluronsyre-stimulerende aktivitet sammenlignet med ingen i voksen sårvæske ^6. Følgelig kan højere niveauer af hyaluronsyre, en glycosaminoglycan, der fremmer en mikromiljø befordrende for cellemotilitet og proliferation i den føtale sårmiljø ansvarlig for scarless fænotype set i den tidlige fosterudvikling. Andre linjer af beviser peger på, at fetal sårmiljø er relativt hypoxemiske og nedsænket i steril fostervand rig på vækstfaktorer ^7. Der er dog ikke endeligt svar er givet for en kritisk begivenhed eller faktor under embryogenese, der udløser overgangen fra scarless regenerering til fibrotisk reparation.

Forstå de mekanismer ansvarlige for scarless helbredelse i fosteret kræver en præcis og reproducerbar model. Her har vi detaljeret en reproducerbar model af føtalt scarless sårheling i dorsum E16.5 (scarless) og E18.5 (ardannelse) museembryoer. Derudover kan mindre ændringer af denne model anvendes til at udføre en række yderligere undersøgelser, såsom genekspression analyse af føtale sår og hud ^8,9. Da netop timede graviditeter er afgørende for en vellykket sammenfatning af denne føtal scarless sårheling model, vi også detaljer vores protokol for superovulation timed graviditeter.

Protocol

BEMÆRK: Alle procedurer er beskrevet i dette dokument, er udført i overensstemmelse med retningslinjer, som Stanford Administrative Panel om Laboratory Animal Care (Aplac). 1. Tidsindstillet graviditeter – Superovulation Teknik (figur 1) BEMÆRK: Netop timing gestationsalder på museembryoer for føtal kirurgi ved E16.5 og E18.5 er af afgørende betydning. I dette afsnit detalje vores protokol for timing mus graviditeter hjælp drægtige hopper serum (PMS) og hum…

Representative Results

For histologisk analyse bør kutane sår i den dorsale hud af E16.5 og E18.5 museembryoer høstes 48 timer efter sårdannelse, fikseret i 4% PFA, og paraffinindstøbt. I fluorescerende transgene modeller, kan kryopræservering med oktober være passende. Der er flere pletter, som kan anvendes til at visualisere celle- og bindevæv arkitektur. Hematoxylin og eosin er en to-farvet plet, pletter kerner blå og eosinofile strukturer (dvs.., Cytoplasma og ekstracellulære collagen) forskellige nuancer af rød, pink …

Discussion

Den kirurgiske protokol præsenteres her beskriver en excisional model af føtalt murine scarless healing først udgivet i 2006 af vores laboratorium ^10. Ud over andre etablerede modeller af excisional såret ^11, incisional modeller af føtal murine scarless healing eksisterer så godt ^12,13. Undersøgelser af føtal scarless sårheling hos aber, lam, kanin, opossum, og rotte er rapporteret ^14-17. Dog udgør mus en ideel model for at udforske føtal scarless sårheling på gru…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
7-O MONOSOF Suture	eSuture	SN-1647G
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650916
Micro-scissors	Kent Scientific	INS600127
Autoclip 9mm	Texas Scientific Instruments	205060
Insulin Syringe	Thermo Fisher Scientific	22-272-382
Black Pigment	AIMS	242
BD Safety-Lok 3ml Syringe	BD Biosciences	309596
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope	Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS)	Millipore	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Sigma-Aldrich	CG10
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (depilatory cream)	Church and Dwight Co.	22600267058