Hurtig identifikation af kemiske genetisk samspil i<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Abstract
Bestemmelse af virkningsmekanismen af bioaktive stoffer er af interesse for en bred vifte af akademiske, farmaceutiske og industrielle forskere. Saccharomyces cerevisiae, eller spirende gær, er en model eukaryot, for hvilken en komplet samling af ~ 6.000 gendeletion mutanter og hypomorphic essentielt gen mutanter er kommercielt tilgængelige. Disse samlinger af mutanter kan anvendes til systematisk at påvise kemisk-gen-interaktioner, dvs. gener er nødvendige for at tolerere et kemikalie. Denne information igen, rapporterer om den sandsynlige virkningsmåde af forbindelsen. Her beskriver vi en protokol til hurtig identifikation af kemisk-genetiske interaktioner i spirende gær. Vi viser fremgangsmåden ved anvendelse af kemoterapeutiske middel 5-fluoruracil (5-FU), som har en veldefineret virkningsmekanisme. Vores resultater viser, at den nukleare TRAMP RNA er behov exosom og DNA reparation enzymer for proliferation i nærvær af 5-FU, hvilket er konsistent med tidligere microarray baserede stregkoder kemiske genetiske tilgange og viden om, at 5-FU negativ indflydelse både RNA og DNA metabolisme. De nødvendige validering protokoller fra disse high-throughput skærme er også beskrevet.
Introduction
De genetiske værktøjer og ressourcer til rådighed i modelorganismen Saccharomyces cerevisiae har aktiveret omfattende genomik undersøgelser, som tilsammen giver ny indsigt i, hvordan generne fungerer som netværk for at opfylde kravene i biologiske systemer. Hjørnestenen i disse værktøjer var den kollaborative oprettelsen af et komplet sæt af ikke-væsentlige gendeletioner af alle åbne læserammer i gær 1,2. Et slående observation var, at kun ~ 20% af gær-gener er nødvendige for levedygtighed, når de dyrkes som haploider under standard laboratoriebetingelser. Dette understreger evne en celle til buffer mod genomiske forstyrrelser gennem anvendelse af alternative biologiske veje. Genetiske mutanter, der er levedygtige individuelt, men dødelig i kombination, signalerer tilsluttet eller konvergente parallelle biologiske veje og danne genetiske interaktionsnetværk der beskriver biologiske funktion. Med udviklingen af betingede temperature følsomme og hypomorphic alleler af essentielle gener teknologien er ikke begrænset til studiet af ikke-væsentlige gener 3,4. Dette koncept er blevet anvendt på et genomisk skala producerer en fordomsfri genetisk samspil kort viser, hvordan gener involveret i lignende cellulære processer klynge sammen 5.
Kemiske perturbationer af genetiske netværk efterligner gendeletioner (figur 1) 6. Forespørger vækstinhiberende forbindelser mod en high-density array af deletionsstammer for overfølsomhed identificerer en kemisk-genetisk samspil profil, dvs. en liste over gener, er forpligtet til at tolerere kemisk stress. Ligesom genetiske interaktioner, har store skærme af kemiske biblioteker vist, at forbindelser med en lignende virkningsmekanisme klynge sammen 7. Derfor ved at etablere den kemisk-genetiske interaktion profil af en forbindelse virkningsmekanismen kan udledes ved at sammenligne den med larGE-skala syntetisk genetiske og kemiske genetiske interaktion datasæt 8,9.
Store kemiske-genetiske skærme, hvor snesevis af forbindelser er afhørt, er blevet udført af stregkode konkurrence- assays. I denne tilgang, er de fælles samling af deletionsstammer dyrket massevis i flere generationer i en lille mængde af medier, der indeholder et kemikalie. Da hver deletionsmutanten huser en unik genetisk stregkode, er levedygtigheden / vækst af individuelle mutanter inden puljen af deletionsstammer spores af microarray eller high-throughput sekventering 10.
Formode fitness ved at overvåge koloni størrelse på fysisk grupperede mutanter dyrket på fast agar indeholdende en bioaktiv forbindelse er også en effektiv metode til at identificere kemiske-genetiske interaktioner 11,12. Denne fremgangsmåde giver en omkostningseffektiv alternativ til konkurrence-baserede screening og er velegnet til at analysere små biblioteker af kemikalier.Her skitserede er en simpel metode til at producere en liste over kemiske-genetiske interaktioner i S. cerevisiae, der ikke er afhængig af molekylærbiologiske manipulationer eller infrastruktur. Det kræver kun en gær sletning samling, en robot eller manuel pinning apparat, og frit tilgængelig billedanalyse software.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her skitserede er en tilgang til at generere kemisk-genetiske interaktion profiler. Fremgangsmåden er enkel: ved at sammenligne koloni størrelser af hver stamme i omfattende gendeletion samlinger i nærvær og fravær af et kemikalie, alle gener, der er nødvendige til at tolerere en kemisk skade identificeret. Annotation berigelse analyse af den resulterende liste over følsomme stammer kan derefter anvendes til at give indsigt i en kemisk virkemåde. Selv denne protokol er blevet optimeret til knopskydende gær, kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen i CJN laboratoriet er støttet af driftstilskud fra NSERC, den canadiske Cancer Society Research Institute (CCSRI), og den canadiske Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
