における化学遺伝の相互作用の迅速な同定<em>サッカロマイセス·セレビシエ</em
Summary
Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Abstract
出芽酵母は、生物活性化学物質の作用機序を学術、製薬、幅広い、および産業科学者に興味がある。決定、または出芽酵母、〜6000の遺伝子の欠失変異体と低形質必須遺伝子のための完全なコレクションのモデル真核生物である変異体は、市販されている。変異体のこれらのコレクションは、系統的に化学物質を許容するために必要な化学-遺伝子の相互作用、 すなわち遺伝子を検出するために用いることができる。この情報は、順番に、化合物の作用の可能性が高いモードに報告します。ここでは、出芽酵母における化学遺伝的相互作用の迅速な同定のためのプロトコルについて説明します。我々は、アクションの明確に定義された機構を有する化学療法剤5-フルオロウラシル（5-FU）を用いた方法を実証する。我々の結果は、核TRAMPのRNAエキソソームおよびDNA修復酵素は、以前メートルと一致する5-FUの存在下で増殖のために必要とされることを示すベースのバーコード化学遺伝学的アプローチおよび5-FUに悪影響RNA及びDNA代謝に影響を与えることを知ってicroarray。これらのハイスループットスクリーニングの必要な検証プロトコルも記載されている。
Introduction
遺伝的ツールとモデル生物出芽酵母で利用可能なリソースを一括遺伝子がネットワークは、生物学的システムの要件を満たすためにとして機能する方法に新たな洞察を提供し、大規模なゲノム機能研究を可能にした。これらのツールの礎石は、酵母1,2内のすべてのオープンリーディングフレームの非必須遺伝子欠失の完全なセットの共同制作だった。顕著な観察は、標準的な実験室条件下で半数体として増殖させた場合の酵母遺伝子のわずか〜20％が生存に必要とされることであった。これは別の生物学的経路を利用して、ゲノムの摂動に対する緩衝する細胞の能力を強調しています。組み合わせて個別に実行可能な、しかし、致死的に接続または収束並列生物学的経路のシグナル及び生物学的機能を説明する遺伝的相互作用のネットワークを形成する遺伝的変異体。条件付きテの発展に伴い必須遺伝子のmperatureに敏感と低次形態対立遺伝子技術は、非必須遺伝子3,4の研究に限定されていません。この概念は、類似の細胞プロセスに関与する遺伝子が5が一緒にクラスタ化方法を説明するための公平な遺伝的相互作用マップを生成するゲノム規模で適用されている。
遺伝子ネットワークの化学摂動模倣遺伝子欠失（ 図1）6。過敏症の削除株の高密度アレイに対して増殖抑制化合物を問い合せると、化学的ストレスに耐えるために必要とされる遺伝子のリスト、つまり 、化学遺伝的相互作用プロファイルを識別します。遺伝的相互作用と同様に、化学ライブラリーの大規模スクリーニングは、一緒に行動クラスタの類似した様式を有する化合物7が示されている。したがって、化合物の化学遺伝的相互作用のプロファイルを確立することによって、作用機序は、LARと比較することによって推測することができるGE-規模合成遺伝的および化学的な遺伝的相互作用のデータセット8,9。
化合物のスコアは、尋問されている大規模な化学遺伝学的スクリーニングでは、バーコードの競合アッセイにより行われてきた。この手法では、欠損株のプールされたコレクションは、化学物質を含有する培地の少量の数世代にわたって一斉に成長させる。各欠失変異体は、固有の遺伝的バーコードを保有するので、欠失株のプール内の個々の突然変異体の生存/増殖は、マイクロアレイまたは高スループット配列10によって追跡される。
生物活性化合物を含む固体寒天上で増殖させた物理的に配列された変異体のコロニーの大きさを監視することにより、適合度を推定することは、化学遺伝的相互作用11,12を識別するための有効な方法である。このアプローチは、競合ベースのスクリーニングの費用対効果の高い代替物を提供し、化学物質の小さなライブラリーをアッセイするために適している。ここで概説S.における化学遺伝的相互作用のリストを生成するための簡単な方法論である分子生物学操作またはインフラストラクチャに依存しない。セレビシエ。のみ酵母削除コレクション、ロボットまたは手動のピン止め装置、及び自由に利用できる画像解析ソフトウェアを必要とする。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明は、化学遺伝的相互作用のプロファイルを生成するためのアプローチである。この方法は単純で、化学物質の存在下および非存在下での総合的な遺伝子欠失コレクション内の各株のコロニーのサイズを比較することにより、化学的傷害を許容するために必要なすべての遺伝子が同定されている。感受性株の結果リストの注釈濃縮分析は、アクションの薬品モードへの洞察を提供す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CJNラボの研究はNSERC、カナダの癌協会研究所（CCSRI）、およびカナダの乳がん財団（BC-ユーコン支店）から操作する補助金によってサポートされています。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
