מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Abstract
קביעת מצב פעולה של כימיקלים ביו-אקטיביים היא עניין למגוון רחב של אקדמיות, תרופות, ומדענים תעשייתיים. Saccharomyces cerevisiae, או שמרי ניצנים, הוא מודל לeukaryote שאוסף של ~ 6000 מוטציות מחיקת גן וגן חיוני hypomorphic מלא מוטציות זמינות מסחרי. אוספים אלה של מוטציות יכולים לשמש כדי לזהות באופן שיטתי אינטראקציות כימיות-גן, גנים כלומר צורך לסבול כימי. מידע זה, בתורו, דיווחים על המצב הסביר של פעולה של המתחם. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי המהיר של אינטראקציות כימיות-גנטית בשמרי ניצנים. אנו מדגימים את השיטה באמצעות הסוכן כימותרפיות 5-fluorouracil (5-FU), שבה יש מנגנון מוגדר היטב של פעולה. התוצאות שלנו מראות כי הנווד הגרעיני RNA אנזימי exosome ותיקון DNA נחוצים לשגשוג בנוכחות 5-FU, שעולה בקנה אחד עם מ 'קודםicroarray גישות המבוססות על קידוד בר כימיות גנטיות והידע ש5-FU משפיע לרעה על חילוף חומרים הן RNA ו- DNA. פרוטוקולי האימות המבוקשות למסכי תפוקה גבוהה אלה גם מתוארים.
Introduction
הכלים ומשאבים זמינים באורגניזם המודל Saccharomyces cerevisiae הגנטיים אפשרו מחקרי גנומיקה התפקודית בקנה מידה גדולה שביחד מספקים תובנה חדשה איך גנים לתפקד כרשתות כדי למלא את הדרישות של מערכות ביולוגיות. אבן הפינה של כלים אלה הייתה היצירה המשותפת של סט שלם של מחיקות גן שאינו חיוניות של כל מסגרות הקריאה הפתוחה בשמרי 1,2. תצפית מדהימה הייתה שרק ~ 20% מגנים של שמרים נדרשים לכדאיות כאשר גדלו כhaploids בתנאי מעבדה סטנדרטיים. זה מדגיש את יכולתו של תא לחיץ נגד הפרעות הגנומי באמצעות הניצול של מסלולים ביולוגיים חלופיים. מוטציות גנטיות כי הן מבחינה אישית, אך קטלניות בשילוב, לאותת מסלולים ביולוגיים מקבילים מחוברים או מתכנסים ויוצרות רשתות אינטראקציה גנטיות המתארות פונקציה ביולוגית. עם התפתחותה של te המותנהאללים mperature רגישים וhypomorphic של גנים חיוניים הטכנולוגיה לא מוגבל למחקר של גנים שאינם חיוניים 3,4. מושג זה יושם בקנה מידה הגנומי לייצר מפת אינטראקציה גנטית משוחדת הממחישה את הגנים מעורבים בתהליכים תאיים דומים להתקבץ יחדיו 5.
הפרעות כימיות של רשתות גנטיות מחיקות גן לחקות (איור 1) 6. שאילתות תרכובות צמיחה מעכבת כנגד מערך צפיפות גבוהה של זני מחיקה לרגישות יתר מזהה פרופיל אינטראקציה כימית-גנטי, כלומר רשימה של גנים שנדרשו לסבול מתח כימי. כמו אינטראקציות גנטיות, מסכי בקנה מידה גדולה של ספריות כימיות הראו כי תרכובות עם מצב דומה של אשכול פעולה יחד 7. לכן, על ידי הקמת פרופיל האינטראקציה הכימית-גנטית של מתחם המצב של פעולה ניתן ללמוד על ידי השוואתו עם larאינטראקציה גנטית וכימית סינתטית ge בקנה המידה גנטית מערכי נתונים 8,9.
מסכי כימיים-גנטית בקנה מידה גדול, שבו עשרות רבות של תרכובות נחקרו, בוצעו על ידי מבחני תחרות ברקוד. בגישה זו, האוסף המשולב של זני מחיקה הוא גדל בהמוניהם לכמה דורות בנפח קטן של מדיה המכילה חומר כימי. מאז כל מוטציה מחיקת נמלים ברקוד גנטי ייחודי, את הכדאיות / הצמיחה של מוטציות בודדות בתוך הבריכה של זני מחיקה היא מעקב על ידי microarray או תפוקה גבוהה רצף 10.
הסיק כושר על ידי ניטור גודל מושבה של מוטציות ערוכות מבחינה פיזית גדלו על אגר מוצק המכיל תרכובת ביו-אקטיבית הוא גם שיטה יעילה לזיהוי אינטראקציות כימיות-גנטי 11,12. גישה זו מספקת חלופה חסכונית להקרנה מבוססת תחרות והוא גם מתאים למנסה לאמוד ספריות קטנות של כימיקלים.מתואר כאן היא מתודולוגיה פשוטה להפקת רשימה של אינטראקציות כימיות-גנטי בS. cerevisiae שאינו מסתמך על מניפולציות מולקולריות ביולוגיה או תשתיות. זה דורש רק אוסף שמרי מחיקה, מנגנון נעיצה רובוטית או ידני, ותוכנת ניתוח תמונה זמינה באופן חופשי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתואר כאן הוא גישה ליצירת פרופילי אינטראקציה כימית-גנטית. השיטה היא פשוטה: על ידי השוואת גדלי מושבה של כל זן באוספי מחיקת גן מקיפים בנוכחות והיעדרות של חומר כימי, כל הגנים הדרושים כדי לסבול עלבון כימי מזוהים. ניתוח העשרת ביאור של הרשימה של זנים רגישים וכתוצאה מכך לאחר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר במעבדה CJN נתמך על ידי מענקים הפועלים מNSERC, הקנדי למלחמה בסרטן אגודת מכון המחקר (CCSRI), והשד הקנדי קרן למלחמה בסרטן (BC-יוקון סניף).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
