إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

الأشعة السينية التصوير مضان يسمح لكل من الهوية وكمية من العناصر الموجودة في عينة لحلها مكانيا. حادث الأشعة السينية، من الطاقة مختارة لتكون أكبر من الإلكترون الطاقة من أعنف عنصر من مصلحة ملزمة، والتغلب على طاقة الربط الإلكترونات الداخلية قذيفة إلى النواة ^1. وهذا يخلق "ثقب" في قذيفة الإلكترون. كما الإلكترونات طاقة أعلى تسقط في هذه الثقوب، وتنبعث الفلورسنت الأشعة السينية التي تعتمد على الطول الموجي فصل الطاقة من تلك المدارات. منذ تباعد الطاقة في المدارات هو سمة من عنصر معين، لديه الانبعاثات مضان الأشعة السينية أيضا موجات مميزة، تعتمد على العنصر. هذا هو الانبعاثات في الطول الموجي المميز الذي يتيح التعرف على العناصر الحالية. معايرة كثافة مضان تسمح الكميات من العناصر الحالية.

الأشعة السينية مضان microscopأصبح ص (XFM) تستخدم على نحو متزايد، ويرجع ذلك جزئيا إلى تطوير مصادر السنكروترون الأشعة السينية رائعة جدا، مثل تلك التي في الربيع-8 في اليابان، ومرفق الأوروبي الإشعاع السنكروترون (ESRF) في فرنسا، وفوتون المصدر المتقدم ( APS) في الولايات المتحدة ^(2). وتوفر هذه المصادر كثافة عالية جدا الحزم الأشعة السينية. في نفس الوقت، وإدخال تحسينات في مجال البصريات والأشعة السينية، مثل تكنولوجيا لوحة منطقة، سمح التركيز من هذه الحزم إلى البقع ميكرون الفرعي، وإن كان غير فعال بدلا ^3. مع جدا الحزم عالية الكثافة، حتى كمية صغيرة نسبيا من الضوء الذي يمكن أن تركز كافية لإثارة المعادن الذاتية في الخلايا، وتنتج إشارة التي يمكن قياسها مع التكنولوجيا كاشف المتاحة حاليا. وهكذا، ودراسة البيولوجيا الكيميائية للمعادن في الخلية هي تطبيق واحد على وجه الخصوص أن يجعل من استخدام العديد من التطورات الأخيرة في هذه التقنية ^4-10.

هناك العديد من العوامل الحاسمة لأخذها في الاعتبار عند التطبيقالكذب XFM للتحقيق في توزيع الأولي والكمي لخلايا الثدييات مثقف أو عينات بيولوجية أخرى. أولا، تحتاج العينة أن تبقى سليمة من الناحية الهيكلية وفيما يتعلق تكوينها عنصر، وذلك لقياس لتكون ذات مغزى. ثانيا، لا بد من الحفاظ على عينة أيضا في بعض الطريق بحيث يكون هاردي إلى أضرار الأشعة التي يمكن أن تسببها تركيزا شعاع الأشعة السينية. إحدى الطرق التي عينة يمكن تلبية كل من هذه المعايير في آن واحد هو أن يتم تجميدها بسرعة إلى الجسم الزجاجي، والجليد غير متبلور ^11،12. كثيرا ما يتم تحقيق التجميد السريع من خلال تقنيات الحفظ بالتبريد مختلفة مثل يغرق تجميد أو ارتفاع ضغط تجميد ^13-16. ومن المسلم به عموما أن الحفظ بالتبريد يحفظ العمارة الخلوية الشاملة والتراكيب الكيميائية في العينات البيولوجية أقرب إلى الدولة الأم وقت ممكن. تثبيت الكيميائية، من ناحية أخرى، ويرجع ذلك إلى انتشار بطيء والانتقائي للمثبتات إلى الخلايا والأنسجة كما ثالذراع تغييرات لاحقة كما في نفاذية الغشاء، قد تسمح مختلف أيونات الخلوية وخاصة أيونات إنتشاري مثل الكلور، الكالسيوم وK إلى أن ترشح، المفقودة أو نقلهم، مما يجعل التحقيق في هذه العناصر دون المستوى الأمثل ^17-19. وعلى الرغم من ميزة واضحة من البرد التثبيت على تثبيت الكيميائية بشكل عام، لخلايا الثدييات ملتصقة على وجه الخصوص، الحفظ بالتبريد لديها مختلف القيود ^20-23. أكثرها وضوحا هو أن ليس كل مختبر البحوث ويسهل الوصول إلى أدوات الحفظ بالتبريد. معظم المجمدات ارتفاع ضغط الحالية أو حتى يغرق المجمدات مكلفة ومملوكة فقط من قبل مجموعة فرعية من مرافق البرد، والتي قد تكون بعيدة عن حيث يتم تحضين الخلايا. قد يتم تداولها صالح الحفظ بالتبريد لعيب الإجهاد السفر المفروضة على الخلايا. وهكذا، في حين الحفظ بالتبريد هو بالتأكيد الطريق الأكثر صرامة للحفاظ على عينات للتحليل مضان الأشعة السينية، فمن المؤكد أنها ليست الأكثر في متناول جميع الباحثين في جميع الظروف.كما أنها ليست دائما ضرورية – إذا كان المعادن ذات الأهمية لا بد بإحكام على الجزيئات يمكن حلها، والقرار الذي سيتم تصويرها على عينة أكبر من الأضرار التي لحقت-المجهرية جدا التي قد تحدث أثناء التجفيف. وإذ تضع في اعتبارها المحاذير ^24، تثبيت الكيميائية وتجفيف قد يكون خيارا مناسبا.

وتشمل العوامل الأخرى في الأشعة السينية تجربة التصوير مضان ناجحة تحليل سليم. الأشعة السينية التصوير مضان هو في الأساس الأشعة السينية الطيفي الانبعاثات مضان جنبا إلى جنب مع النقطية المسح إلى توفير تحليل المكاني. أطياف الانبعاث مضان الأشعة السينية التي تم جمعها تحتوي على مزيج من تداخل القمم الانبعاثات، الخلفية، والقمم نثر المرنة وغير المرنة من شعاع الحادث. البرمجيات التي تمكن من الإلتواء اجتثاث هذه المساهمات، وتركيب قمم الانبعاثات كان، وهو تطور حاسمة في هذا المجال ^25. أيضا، وتطوير وشعبة نظم التجاريribution المعايير الأغشية الرقيقة من تكوين معروفة، وتستخدم لمعايرة كثافة مضان بالنسبة لكمية المواد، وقد تم أيضا مهم جدا.

يوفر هذا البروتوكول وصفا لإعداد الخلايا الملتصقة من قبل التثبيت الكيميائية والتجفيف في الهواء. خطوة حيوية في هذه العملية هي نمو الخلايا على النوافذ نيتريد السيليكون، والتي غالبا لا تلتزم بشكل جيد، مما يجعل الشطف لطيف في مفتاح الأزياء معين لتحقيق النجاح.

Protocol

1. إعداد الآلات، ركائز، الثقافة وسائل الإعلام وأطباق التعامل مع من السيليكون نتريد (سي 3 ن 4) النوافذ. فتح الكبسولة قليلا من خلال الضغط على نهاية واحدة تحتوي ع…

Representative Results

قدرة التصوير مضان الأشعة السينية لتوفير المعلومات حول العينات البيولوجية تتوقف على هذه العينات التي يجري إعدادها في مثل هذه الطريقة أنها متماسكة إلى أضرار الإشعاع على مقياس الوقت من التجربة، وبعد هم الكيميائية والسمات الهيكلية بشكل جيد الحفاظ عليها. في عرض نتيجة ا?…

Discussion

الأشعة السينية التصوير مضان مفيد في العديد من المجالات، بما في ذلك علوم الأرض، وعلوم المواد، والبيولوجيا الكيميائية ^26-34. أنتجت التقدم في السنكروترون الأشعة السينية، والتركيز، وللغاية الحزم عالية الكثافة. الحزم تركيزا الأشعة السينية كافية لإثارة المعادن المح…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde