הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

X-ray הדמיה הקרינה מאפשרת לשניהם זהות והכמות של אלמנטים קיימים במדגם להיפתר במרחב. תקרית צילומים רנטגן, של אנרגיה נבחרה להיות גדול יותר מהאלקטרון מחייב אנרגיה של היסוד הכבד ביותר של עניין, להתגבר על אנרגית הקשר של אלקטרונים פנימי קליפה לגרעין ^1. זה יוצר "חור" בקליפת האלקטרונים. כאלקטרונים גבוהות אנרגיה ליפול לתוך חורים אלה, צילומי רנטגן ניאון נפלטים אורך הגל שהוא תלוי בהפרדת האנרגיה של אורביטלים אלה. מאז את מרווח האנרגיה של אורביטלים אופייני לאלמנט מסוים, פליטת הקרינה X-ray יש גם אורכי גל אופייניים, תלוי באלמנט. זה פליטה זה באורך גל אופייני המאפשר זיהוי של האלמנטים הנוכחיים. כיול של עוצמת הקרינה מאפשר לכמת את האלמנטים הנוכחיים.

microscop הקרינה רנטגןy (XFM) הפך יותר ויותר מנוצל, בין ההיתר בשל פיתוח מקורות מאוד מבריקים X-ray סינכרוטרון, כגון אלה באביב-8 ביפן, המתקן האירופי הקרינה Synchrotron (ESRF) בצרפת, והפוטון המתקדם המקור ( APS) בארה"ב ^2. מקורות אלה מספקים קורות X-ray גבוהה מאוד בעוצמה. באותו הזמן, שיפורים באופטיקה רנטגן, כגון טכנולוגית צלחת האזור, אפשרו התמקדות של קורות אלה לכתמים תת-מיקרון, אם כי לא באופן בלתי יעיל ^3. עם מאוד קורות בעוצמה גבוהה, גם כמות קטנה יחסית של אור שיכול להיות ממוקדת מספיק כדי להלהיב את מתכות אנדוגני בתאים, אות ייצור שניתן למדוד עם טכנולוגית גלאי זמינה כרגע. כך, מחקר על הביולוגיה הכימית של מתכות בתא הוא יישום אחד בפרט שעושה שימוש ברבים מההתפתחויות האחרונות בטכניקה זו ^4-10.

ישנם גורמים קריטיים רבים כדי להיחשב בעת יישוםשוכב XFM לחקור את ההפצה וכימות הבסיסיות של תאי יונקים בתרבית או דגימות ביולוגיות אחרות. ראשית, המדגם צריך להיות כל הזמן בשלמות, גם מבני והן ביחס לרכב היסודות שלה, על מנת שהמדידה יהיה משמעותי. שנית, המדגם חייב גם יישמר בדרך כלשהי, כך שהוא קשוח לניזקי הקרינה שיכול להיגרם על ידי קרן רנטגן ממוקדת. אחת דרכים שמדגם יכול לפגוש שני הקריטריונים הללו בבת אחת הוא להיות מוקפאים במהירות לתוך קרח זגוגי, אמורפי ^11,12. הקפאה מהירה מושגת לעתים קרובות באמצעות טכניקות שונות, כגון הקפאת הקפאה לצלול או בלחץ גבוה הקפאת ^13-16. הדעה מקובלת היא שההקפאה שומרת ארכיטקטורה הסלולר כוללת והרכבים כימיים בדגימות ביולוגיות קרובות למצב טבעי ככל האפשר. קיבעון כימי, ומצד שני, בשל החדירה האיטית וסלקטיבית של fixatives לתאים ורקמות כמו well שינויים לאחר כבחדירות קרום, עשויים לאפשר יונים סלולריים שונים במיוחד יוני diffusible כגון Cl, Ca ו- K להיות דלפו, שאבדו או הועברו, וכך הופכים חקירה של האלמנטים האלה לא טובים ^17-19. למרות היתרון ברור של cryo-קיבעון על קיבעון כימי באופן כללי, לתאי יונקים חסיד בפרט, יש הקפאת מגבלות שונות ^20-23. הברור ביותר הוא שלא לכל מעבדת מחקר גישה קלה למכשירי הקפאה. רוב המקפיאים לחץ גבוה הנוכחיים או אפילו לצלול מקפיאים הם יקרים ובעלות רק על ידי קבוצת משנה של מתקני cryo, אשר עשויים להיות רחוק מהמקום שבי תאים מודגרת. היתרון של הקפאה עשוי להיסחר בחסרון של מתח נסיעות מונח על התאים. וכך, בעוד ההקפאה היא ללא ספק הדרך המחמיר ביותר לשמירת דגימות לבדיקת הקרינה רנטגן, זה בהחלט לא נגיש ביותר לכל החוקרים בכל הנסיבות;זה גם לא תמיד חיוני – אם המתכות של ריבית הדוקה למקרו-מולקולות הניתנים לקביעה, ואת הרזולוציה שבי המדגם יהיה צילמה גדולה מהניזק לאולטרה-המייקר שעלול להתרחש במהלך ייבוש. מודע לאזהרות ^24, קיבעון כימי וייבוש עשוי להיות בחירה מתאימה.

גורמים אחרים בניסוי הדמיה הקרינה רנטגן מוצלח כוללים ניתוח נכון. ההדמיה הקרינה רנטגן היא ביסוד ספקטרוסקופיה פליטת הקרינה רנטגן בשילוב עם סריקה סריקה כדי לספק רזולוציה מרחבית. ספקטרום פליטת הקרינה X-ray שנאסף מכיל שילוב של חופף פסגות פליטה, רקע, ואת פסגות פיזור אלסטי והקשיחות של קורה האירוע. תוכנה המאפשרת דה-פיתול של תרומות אלה, וראויים של פסגות הפליטה, הייתה התפתחות קריטית לתחום זה ^25. כמו כן, הפיתוח וdist המסחריribution של תקני סרט דק של הרכב ידוע, המשמש לכיול עוצמת הקרינה יחסית לכמות חומר, גם היה מאוד חשוב.

פרוטוקול זה מספק תיאור של הכנת תאים חסיד ידי קיבוע כימי וייבוש באוויר. צעד חיוני בתהליך זה הוא הצמיחה של התאים על חלונות סיליקון ניטריד, אשר לעתים קרובות אינו דבקים גם, מה שהופך את השטיפה עדינה במפתח אופנה מסוים להצלחה.

Protocol

1. הכנה של מכשירים, מצעים, תרבות מדיה וכלים טיפול של הסיליקון Nitride (Si 3 N 4) חלונות. לפתוח את הכמוסה מעט על ידי סחיטת קצה אחד המכיל את החלון באופן שלא לסחוט את החל?…

Representative Results

היכולת של הדמיה הקרינה רנטגן על מנת לספק מידע על דגימות ביולוגיות מותנית דגימות אלה שמכינים באופן כזה שהם חזקים לנזקי קרינה בזמן בקנה המידה של הניסוי, ובכל זאת הכימית שלהם והתכונות מבניות היטב השתמר. בצפיית התוצאה ממדגם שהוכן כפי שתואר לעיל וצלם, אפשר לראות שיש שוני ?…

Discussion

ההדמיה הקרינה רנטגן שימושית בתחומים רבים, כולל geosciences, מדע חומרים, וביולוגיה כימית ^26-34. התקדמות בצילומי רנטגן סינכרוטרון, והפוקוס שלהם, יצרה מאוד קורות בעוצמה גבוהה. X-ray הממוקד קורות מספיק כדי לעורר את מתכות אנדוגני בתאים קיימות כיום, לייצר אות שניתן למדוד עם טכנ…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde