Forbereder Adherent Cells for X-ray fluorescens Imaging ved Kjemisk Fixation

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

Røntgen fluorescens bilde tillater både identiteten og mengden av elementer som er tilstede i en prøve som skal romlig løst. Innfallende røntgenstråler, av en energi valgt til å være større enn elektron-bindingsenergien av den tyngste element av interesse, å overvinne bindingsenergien av det indre skall elektroner til kjernen ^1. Dette skaper et "hull" i elektronskallet. Som høyere energi elektronene faller ned i disse hull, blir fluorescerende røntgenstråler utsendes hvis bølgelengde avhenger av energi separasjon av disse orbitaler. Siden avstanden mellom orbitaler energi er karakteristisk for et gitt element, har røntgen-fluorescens-emisjon også karakteristiske bølgelengder, avhengig av elementet. Det er denne emisjon ved en karakteristisk bølgelengde som tillater identifisering av de tilstedeværende elementer. Kalibrering av fluorescens-intensitet tillater kvantifisering av de tilstedeværende elementer.

X-ray fluorescens microscopy (XFM) har blitt stadig mer brukt, delvis på grunn av utviklingen av svært strålende X-ray synkrotron kilder, slik som de på Spring-8 i Japan, den europeiske Radiation Synchrotron Facility (ESRF) i Frankrike, og Advanced Photon Source ( APS) i USA ^to. Disse kildene gir svært høy intensitet X-ray bjelker. På samme tid, forbedringer i røntgen optikk, slik som soneplate teknologi, tillot fokusering av disse bjelker i sub-mikron flekker, riktignok ganske ineffektivt ^3. Med svært høy intensitet bjelker, og med en relativt liten mengde lys som kan være fokusert er tilstrekkelig til å opphisse de endogene metaller i cellene, produsere signal som kan måles med tiden tilgjengelig detektorteknologi. Således studere den kjemiske biologi av metaller i cellen er en anvendelse i særdeleshet som gjør bruk av mange av de nyere utviklinger i denne teknikken ^4-10.

Det er mange kritiske faktorer som skal vurderes mens appliggende XFM å undersøke de elementære distribusjon og kvantifisering av dyrkede pattedyrceller eller andre biologiske prøver. For det første må prøven som skal holdes intakt, både konstruksjonsmessig og med hensyn til sin grunnsammensetning, for måling skal være meningsfylt. For det andre må prøven også bli konservert på en eller annen måte slik at den er hardfør til skaden stråling som kan være forårsaket av en fokusert røntgenstråle. En måte at en prøve kan oppfylle begge disse kriteriene på en gang, er å bli hurtig frosset i et glassaktig, amorft, is ^11,12. Rapid frysing oppnås ofte gjennom ulike nedfrysing teknikker som stupe frysing eller høytrykks frysing ^13-16. Det er generelt akseptert at nedfrysing bevarer totale cellulære arkitektur og kjemiske sammensetninger i biologiske prøver så nær naturlig tilstand som mulig. Kjemisk fiksering, på den annen side, på grunn av den langsomme og selektiv gjennomtrengning av bindemiddel inn i celler og vev som well som senere endringer i membran permeabilitet, kan tillate ulike cellulære ioner spesielt bærerdiffunderbare ioner som Cl, Ca og K for å bli utvasket, tapte eller flyttet, og dermed gjengivelse etterforskning av disse elementene suboptimale ^17-19. Til tross for den klare fordelen av kryo-fiksering i løpet av kjemisk fiksering generelt, for adherente pattedyrceller i særdeleshet, har nedfrysing forskjellige begrensninger ^20-23. Den mest åpenbare er at ikke alle forskningslaboratorium har lett tilgang til nedfrysing instrumenter. De fleste nåværende høytrykks frysere eller styrter frysere er kostbare og bare eies av en undergruppe av kryo anlegg, som kan være langt fra der cellene inkuberes. Nytten av nedfrysing kan bli omsatt for den ulempe at de for stress plassert på cellene. Således, mens nedfrysing er sikkert den mest grundige måten å bevare prøver for X-ray fluorescens analyse, er det absolutt ikke det mest tilgjengelige for alle forskere under alle omstendigheter;det er heller ikke alltid nødvendig – hvis metallene av interesse er tett bundet til an å fikse makromolekyler, og oppløsningen som utvalget skal avbildes er større enn skadene på ultra-mikrostruktur som kan oppstå under tørking. Oppmerksom på de begrensningene ^24, kan kjemisk fiksering og tørking være et passende valg.

Andre faktorer i en vellykket X-ray fluorescens bildebehandling eksperiment inkluderer riktig analyse. X-ray fluorescens bildebehandling er fundamentalt X-ray fluorescens emisjonsspektrometrisk kombinert med raster-skanning for å gi romlig oppløsning. X-ray fluorescens utslipps spektra innsamlet inneholde en kombinasjon av overlappende utslipps topper, bakgrunn og de elastiske og uelastisk spredning toppene i innfallende strålen. Programvare som gjør at de-konvolusjon av disse bidragene, og montering av utslipps topper, har vært en kritisk utvikling av dette feltet ^25. Også, utvikling og kommersiell distribution av tynnfilm standarder med kjent sammensetning, som brukes til å kalibrere fluorescens intensitet i forhold til materialmengden, har også vært svært viktig.

Denne protokollen gir en beskrivelse av fremstillingen av adherente celler ved kjemisk fiksering og lufttørking. Et viktig steg i denne prosessen er veksten av cellene på silisiumnitridpartiklene vinduer, som ofte ikke holder seg godt, noe som gjør skånsom skylling i en bestemt måte nøkkelen til suksess.

Protocol

1. Klargjøring av instrumenter, Underlag, Kultur Media og Retter Håndtering av Silisiumnitrid (Si 3 N 4) vinduer. Åpne kapselen lett ved å klemme den ene enden som inneholder vinduet på en slik måte at det ikke presse vinduet i seg selv, mens den roterer den andre enden av kapselen med den andre hånden. Sjekk et par revers, for å fin-tipped pinsett henhold stereo sørge for at det ikke er noen lim, hull eller svinger på spissen. Ellers kan vinduene bli brutt a…

Representative Results

Evnen til X-ray fluorescens bildebehandling for å gi informasjon om biologiske prøver er betinget av disse prøvene være forberedt på en slik måte at de er robuste til stråleskader på tidsskala av eksperimentet, og likevel deres kjemiske og strukturelle trekk er godt bevart. I viser resultatet av en prøve som har blitt fremstilt som beskrevet ovenfor og avbildes, er det mulig å se at det er variasjon i de tilstedeværende elementer – som indikerer at fikseringen bevares disse sidene av cellen (figur 1)….

Discussion

X-ray fluorescens bildebehandling er nyttig i mange felt, blant annet geofag, materialvitenskap, og kjemisk biologi ^26-34. Fremskritt innen synkrotron røntgen, og deres fokus, har produsert svært høy intensitet bjelker. Fokusert røntgen bjelker tilstrekkelig til å eksitere de endogene metaller i celler som nå eksisterer, produserer signalet som kan måles med tiden tilgjengelig silisium drift detektorteknologi. Og studere den kjemiske biologi av metaller i cellen er ett program spesielt som gjør bruk a…

Materials

silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde