Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung<em> In-vitro-</em> Und<em> In-vivo-</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
Aufgrund der hohen Heterogenität und Mutationen in der menschlichen Krebsarten, einzelnes Mittel Therapien oder Kombinationstherapien, die den gleichen Weg zielen, sind wahrscheinlich versagen. Der Nachdruck auf die Hemmung der Pfade bei der intrinsischen und / oder adaptive Therapieresistenz verantwortlich sind, platziert werden. Ein aktives Forschungsgebiet ist die Entwicklung und Erprobung von DNA-Reparatur-Inhibitoren, die die Wirkung von zu fördern und zu verhindern, Widerstand gegen, häufig verwendete Chemotherapie und Strahlentherapie. Wir verwendeten eine neue Methode, um die Wirksamkeit der BRCA2 Hemmung als Mittel zur Tumorzellen mit der DNA-schädigenden Medikament Cisplatin sensibilisieren bewerten. Tumorzellstoffwechsel (Versauerung und Atmung) wurde in Echtzeit über einen Zeitraum von 72 Stunden, um die Wirksamkeit der Behandlung auf einem von Minute zu Minute Grundlage abzugrenzen überwacht. In Kombination, eine Bewertung der metastatischen Frequenz führten wir mit einem Hühnerembryo Chorioallantoismembran (CAM) Modell der Extravasation und Invasion. DieseProtokoll behandelt einige Schwächen üblicherweise in vitro und in vivo-Verfahren verwendet werden, um neue Krebstherapieschemata zu bewerten. Es kann neben üblichen Methoden wie Zellproliferationsassays, Zelltod Assays verwendet werden, und in vivo murine Xenograft Studien genauer unter in Frage kommenden Zielen und Mitteln unterscheiden und wählt nur die aussichtsreichsten Kandidaten für eine weitere Entwicklung.
Introduction
Erworbener Resistenz gegen gezielte und / oder zytotoxischen Krebsbehandlung ist ein wichtiges klinisches Problem, die zum Therapieversagen, Rückfall führen kann, und eine erhöhte Patientensterblichkeit 1. Angesichts der hohen Heterogenität in den meisten Tumoren, es ist eine mathematische Gewissheit, dass ein Tumor ausreichend hohe Zellzahl wird eine Untergruppe von Zellen resistent gegen einzelne oder kombinierte Therapien, die molekularen Wege, auf denen diese Zellen hängen zum Überleben 2,3 enthalten. Solche Tumorzellen können für den während der Behandlung ausgewählt werden, was zu einem Rezidiv. Entwicklung neuer Therapien, die gleichzeitig unterschiedliche Zielkrebszellüberlebensmechanismen, entweder vor oder nach der Behandlung vermittelte Selektion ist deshalb klinisch wichtig.
Ein hohes Maß an Genominstabilität und Mutation in Tumor Genome ist eine grundlegende Eigenschaft, die Krebszellen aus Nicht-Tumorwirtszellen 4 unterscheidet. Folglich wird ein useful-Strategie, um die Wirksamkeit von DNA-schädigenden Chemotherapie zu erhöhen und die Entwicklung einer Resistenz zu verhindern ist, DNA-Reparatur hemmen aktiv in Tumorzellen 5. Dies ist ein aktives Forschungsgebiet und eine Vielzahl von neuen DNA-Reparatur-Ziele werden in einem präklinischen Einstellung erforscht. Eine Anzahl von kleinen Molekülen oder Antisense-basierte Inhibitoren dieser Ziele entwickelt und werden in der Erprobung 6-8. Das Ziel ist es, die vielversprechendsten präklinischen Kandidaten in klinischen Studien zu erkennen und bewerten ihre Sicherheit und Wirksamkeit.
Die hohen Kosten der klinischen Versuche und die Gefahr einer Störung (für eine Vielzahl von Gründen, einschließlich suboptimaler präklinische Bewertung) sind gewaltige Hindernisse in die Entwicklung von neuen Therapien 9 voran. Die Verwendung geeigneter und strengen präklinischen Modellen angemessen neue therapeutische Targets und Wirkstoffkandidaten beurteilen kann die hohe Ausfallrate von 10 klinischen Studien zu verringern </sup>.
A) Messung der Fähigkeit, die Tumorzellproliferation in vitro (Zellproliferationsassays), b) Therapie-induzierte Verringerung der Kapazität von Tumorzellen zu verringern: Einige häufig verwendete vorklinischen Verfahren, die Wirksamkeit von neuen Antikrebs-Therapien sind, beurteilen Form Gewebekulturkolonien (kolonieBildungsTests), c) Therapie-induzierte Verringerung des Tumorzellstoffwechselaktivität in vitro (Redoxfarbstoff Umwandlung), d) Therapie-induzierte Induktion in vitro Tumorzelltodes (Apoptose, Nekrose, phage, zugeordnet mit der Mitose und weitere) 11, und e) in vivo-Therapie-induzierte Reduktion des Wachstums oder der Ablation von menschlichen und Maus-Xenotransplantaten 12-14.
Eine Hauptschwäche der angeführten in vitro Verfahren ist, dass keine von ihnen eine kontinuierliche Echtzeit-Auswertung der Wirkung der Kandidatentherapie. Vielmehr nur an ausgewählten, weit auseinanderZeitPunkten liefern sie Informationenwährend des Verlaufs der Behandlung. Solche Messungen haben Kapazitäten, um die Größe und den Zeitpunkt des Tumorzellantworten genau widerspiegeln vermindert. In vivo-Maus-Xenograft-Modelle werden auch durch hohe Kosten, Zeitdauer in Anspruch, und das Risiko von suboptimalen Dosierungen und Verabreichungszeitpunkt (Scheduling) begrenzt. Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass Nager Xenotransplantatmodellen begrenzt Prädiktoren für die klinische Wirksamkeit in Menschen im Vergleich zu in-vitro-Bewertung der Reaktionen von primären humanen Tumorzellen und etablierten menschlichen Tumorzellinien Kandidaten therapeutische Interventionen 15,16.
Wir entwickelten eine neuartige Kombinationsprotokoll neue Arzneimittelkombinationen vorklinisch auszuwerten, in einer Weise, die die Schwächen der oben genannten üblichere Verfahren adressiert. An die Stelle der Proliferation, Koloniebildung oder Redoxfarbstoff Umwandlung Tests verwendeten wir einen Stoffwechsel Maßeinheit Zelladhäsion, Atmung und die Versauerung in Echtzeit zu analysierenwährend des gesamten Behandlungszeitraums 17. Gleichzeitig untersuchten wir die Auswirkungen der Behandlung Kombination in vivo durch die Verwendung eines Hühnerembryo Chorioallantoismembran (CAM) Modell der Invasion und Metastasierung von 18,19. Wir verwendeten diese Methoden, um die Fähigkeit eines Antisense-Oligonukleotid (ASO) Targeting BRCA2, um die Wirksamkeit der üblicherweise verwendeten chemotherapeutischen Arzneimittel Cisplatin potenzieren bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund der inhärenten Kosten und Risiken im Zusammenhang mit klinischen Studien, es notwendig ist, bessere und strengere präklinischen Testverfahren, um neue Anti-Krebs-Behandlung nicht ausreichend adäquat bewerten zu entwickeln. Strom häufigsten verwendeten Techniken alle Schwächen aufweisen, die ihre Fähigkeit, zwischen potentiell vielversprechende therapeutische Ziele / Agenten diskriminieren begrenzen kann, und jene, die weniger wirksam sein kann. Wir entwickelten ein Protokoll, um neue anti-Krebs Ansätze, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit durch Zuschüsse zu JK aus den Ontario Centres of Excellence und dem Ontario Research Fund ermöglicht.
Wir möchten Siddika Pardhan und Dr. Peter Ferguson, um technische Unterstützung während der Dreharbeiten zu danken.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
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