Utvärdera effektiviteten i Cancer Drug Sensibilisering<em> In Vitro</em> Och<em> In Vivo</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
På grund av den höga graden av heterogenitet och mutationer inneboende i human cancer, monoterapi terapier, eller kombinationsregimer som riktar sig mot samma väg, kommer sannolikt att misslyckas. Tonvikten måste läggas på hämningen av vägar som är ansvariga för inneboende och / eller adaptiv resistens mot terapi. En aktiv område som ska undersökas är utveckling och testning av DNA reparationshämmare som främjar verkan av, och förebygga resistens mot, som vanligen används kemoterapi och strålbehandling. Vi använde en roman protokoll för att utvärdera effektiviteten i BRCA2 inhibition som ett sätt att sensibilisera tumörceller till DNA skadande drog cisplatin. Tumörcellmetabolism (försurning och respiration) övervakades i realtid under en period av 72 timmar för att avgränsa behandlingseffekt på en minut för minut basis. I kombination, utförde vi en bedömning av metastaserad frekvens med en kyckling embryo korioallantoinmembranet (CAM) modell av extravasering och invasion. DettaProtokollet tar upp några av de svagheter som vanligen används in vitro och in vivo-metoder för att utvärdera nya cancerterapikurer. Den kan användas som tillägg till vanliga metoder såsom cellproliferationsanalyser, celldöd analyser och in vivo murina xenograft studier, att närmare diskriminera bland kandidat mål och agenter, och väljer bara de mest lovande kandidaterna för vidare utveckling.
Introduction
Förvärvad resistens till målinriktade och / eller cytotoxiska cancerbehandling är ett viktigt kliniskt problem som kan leda till behandlingssvikt, återfall, och ökad patientdödlighet 1. Med tanke på den höga nivån av heterogenitet i de flesta tumörer är det en matematisk säkerhet att en tumör i tillräckligt hög cellantal kommer att innehålla en delmängd av celler som är resistenta mot enstaka eller kombinerade terapier riktade molekylära vägar som dessa celler är beroende för sin överlevnad 2,3. Sådana tumörceller kan selekteras positivt för under behandlingen, vilket leder till sjukdomsåterfall. Utveckling av nya behandlingsmetoder som samtidigt riktar olika mekanismer cancercellöverlevnad, antingen före eller efter behandling medierad val, är alltså kliniskt viktiga.
En hög nivå av genomet instabilitet och mutation i tumör genomen är en grundläggande egenskap som skiljer cancerceller från icke-tumörvärdceller 4. Följaktligen en useful strategi att öka effektiviteten av DNA-skada kemoterapi och för att förhindra utveckling av resistens är att aktivt hämmar DNA-reparation i tumörceller 5. Detta är en aktiv undersökningsområde och en mängd nya DNA-reparations mål undersöks i en pre-klinisk miljö. Ett antal små molekyler eller antisense-baserade hämmare av dessa mål har utvecklats och genomgår testning 6-8. Målet är att identifiera de mest lovande prekliniska kandidater och utvärdera deras säkerhet och effekt i kliniska prövningar.
De höga kostnaderna för kliniska prövningar och risken för misslyckande (för en rad olika skäl, inklusive suboptimal preklinisk utvärdering) är enorma hinder för framsteg i utvecklingen av nya behandlingsmetoder 9. Användningen av lämpliga och rigorösa prekliniska modeller att adekvat bedöma nya terapeutiska mål och läkemedelskandidater kan minska den höga felfrekvensen av kliniska prövningar 10 </sup>.
Några ofta använda pre-kliniska metoder för att utvärdera effektiviteten av nya anti-cancer regimer är: a) mätning av kapaciteten för att minska tumörcellsproliferation in vitro (cellproliferationsanalyser), b) terapi-inducerade kapacitetsminskning av tumörceller till formulär vävnadsodlingskolonier (kolonibildning analyser), c) terapi-inducerad reduktion i tumörcell metabolisk aktivitet in vitro (redox-färgämne omvandling), d) terapi-inducerad induktion av in vitro-tumörcelldöd (apoptotiska, nekrotiska, autophagic, associerad med mitos och andra) 11, och e) in vivo terapi-inducerad reduktion av tillväxt eller ablation av mänskliga och mus xenotransplantat 12-14.
En stor svaghet i de listade in vitro-metoder är att ingen av dem ge kontinuerligt i realtid utvärdera effekten av kandidatterapier. Snarare ger de uppgifter endast på utvalda, allmänt åtskilda tidpunkterunder behandlingen. Sådana mätningar har minskat kapaciteten att korrekt återge storleken och tidpunkten för tumörcellsvar. In vivo mus xenograft modeller begränsas också av höga kostnader, tid att slutföra, och risken för suboptimal dosering och behandling timing (schemaläggning). Dessutom finns det bevis för att gnagare xenograft modeller är begränsade prediktorer för klinisk effekt hos människor, jämfört med in vitro bedömning av svaren från primära humana tumörceller och etablerade humana tumörcellslinjer till kandidat terapeutiska interventioner 15,16.
Vi utarbetat en ny kombination protokoll för att utvärdera nya läkemedelskombinationer prekliniskt, på ett sätt som tar upp de svagheter de vanligaste förfaranden som anges ovan. I stället för spridning, kolonibildning, eller redox-dye konverterings analyser, utnyttjade vi en ämnesomsättning mätenhet för att analysera celladhesion, andning, och försurning i realtidunder hela behandlingsperioden 17. Samtidigt som vi undersökte effekterna av behandlingskombination in vivo genom att använda en kyckling embryo korioallantoinmembranet (CAM) modell för invasion och metastas 18,19. Vi använde dessa metoder för att utvärdera förmågan hos en antisensoligonukleotid (ASO) inriktning BRCA2 att förstärka effektiviteten av de vanligaste kemoterapeutiska läkemedel cisplatin.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av den inneboende kostnad och risk förknippad med kliniska prövningar, finns det ett behov av att utveckla bättre och mer rigorösa preklinisk testning metod för att på lämpligt sätt utvärdera nya anti-cancer behandlingsregimer. Aktuella ofta använda tekniker alla uppvisar svagheter som kan begränsa deras förmåga att skilja mellan potentiellt lovande terapeutiska mål / agenter, och de som kan vara mindre effektiva. Vi utarbetat ett protokoll för att utvärdera nya anti-cancer metoder som tar upp …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har möjliggjorts genom bidrag till JK från Ontario spetsforsknings och Ontario forskningsfonden.
Vi vill tacka Siddika Pardhan och Dr Peter Ferguson för tekniskt stöd under inspelningen.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined ‘Complementary Lethality’. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. . Clinical trials in oncology. 28, (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
