Sedimente Equilibrium av en Small Oligomer dannende Membran Protein: Effekt av Histidin Protonering på pentamer Stabilitet

Summary

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Abstract

Analytiske ultrasentrifugering (AUC) kan brukes til å studere interaksjoner mellom reversible makromolekyler over et vidt område av interaksjons sterke og under fysiologiske betingelser. Dette gjør AUC en metode for valg til kvantitativt vurdere støkiometri og termodynamikk av homo- og hetero forening som er forbigående og reversible i biokjemiske prosesser. I modalitet av sedimente likevekt (SE), en balanse mellom diffusjon og sedimentering gir en profil som en funksjon av radiell avstand som er avhengig av en spesifikk assosiasjon modell. Heri er en detaljert SE protokoll beskrevet for å bestemme størrelsen og monomer-monomer krets energi av en liten membranprotein-oligomer ved anvendelse av en analytisk ultrasentrifuge. AUC-ES er etikett-fritt, bare er basert på fysiske prinsipper, og kan brukes på begge vannoppløselige og membranproteiner. Et eksempel er vist på sistnevnte, små hydrofobe (SH) protein i humant respiratorisk syncytialvirus (HRSV), En 65-aminosyre-polypeptid med en enkelt α-heliks transmembran (TM) domene som danner pentamere ionekanaler. NMR-baserte strukturelle data viser at SH-proteinet har to protonerbar His-rester i sitt transmembrane domene som er orientert som vender mot hulrommet i kanalen. SE forsøk har blitt utviklet for å bestemme hvor pH påvirker assosiasjonskonstanten og oligomere størrelsen av SH-protein. Mens pentamer form ble bevart i alle tilfeller ble det assosiasjonskonstanten reduseres ved lav pH. Disse data er i overensstemmelse med en tilsvarende pH-avhengighet observert for SH kanalaktivitet, i samsvar med en lumenal orientering av de to His-restene i SH-protein. Sistnevnte kan oppleve elektrostatisk frastøting og redusert stabilitet oligomer ved lav pH. I sammendrag, er denne fremgangsmåte anvendbar når kvantitativ informasjon om subtile protein-protein forening endringer i fysiologiske betingelser må måles.

Introduction

Analytiske ultrasentrifuge ^1-5 er en av de viktigste metodene for å studere interaksjoner mellom makromolekyler under fysiologiske betingelser, være tilgjengelig for både svake og sterke interaksjoner. Metoden er etiketten fritt og bruker lysabsorpsjonen eller forstyrrelser, og til og med fluorescens-optiske systemer kan brukes for å få tilgang til konsentrasjonsområder over flere størrelsesordener ^6.

Denne metoden er spesielt nyttig siden de fleste biokjemiske prosesser avhenger av reversible interaksjoner. Støkiometrien og styrken av disse interaksjonene må være kvantitativt karakterisert forstå biologiske prosesser, og en rekke metoder finnes for dette formålet ^{7, 8.} Men forbigående samhandling er vanskelig å studere ^ni.

Valget av en fremgangsmåte for å karakterisere makromolekylære interaksjoner er avhengig av statisk eller dynamisk natur. I det første tilfellet, sedim sentasjonen hastighet (SV) anvendes, hvor frekvensen av radial transport måles og komplekser blir fraksjonert på grunnlag av forskjeller i flytende masse og form.

I kontrast, dynamiske foreninger som er reversibel på tidsskalaen av eksperimentet kan ikke være fysisk adskilt. I dette tilfelle selv- eller hetero-interaksjoner som fører til ikke-kovalente interaksjoner er i en likevekt som er avhengig av den totale proteinkonsentrasjonen. Disse dynamiske interaksjoner kan studeres ved både sedimente likevekt (SE) og sedimenteringshastighet (SV) ^10. Imidlertid er den første fremgangsmåten enklere å utføre, og er beskrevet her. I SE, blir sentrifugering utført ved en tilstrekkelig lav hastighet slik at en likevekt er nådd mellom diffusjon og sedimentering. På dette punkt likevektsprofil av et optisk signal (UV-VIS) som en funksjon av radiell avstand, kan analyseres ved hjelp av forhåndsinnstilte termodynamiske modeller for assosiasjoner ^11.

ve_content "> I den foreliggende papir, er en sedimenteringslikevekt studie presentert av den selv-assosiasjon av et viralt membranprotein som danner ionekanaler. På grunn av dets hydrofobisitet, ble forsøket kjørt i nærvær av detergent, og i dette tilfellet tettheten av Løsningsmidlet må være avstemt til den av vaskemiddel. Imidlertid protokollen som er beskrevet ville identisk i tilfelle av en vannløselig protein, bortsett fra at ikke noe løsningsmiddel tetthet tilpasning ville være nødvendig.

Proteinet som brukes er kodet i den menneskelige respiratorisk syncytialvirus (HRSV), en omhyllet pneumovirus i Paramyxoviridae familien som forårsaker nedre luftveissykdom hos spedbarn, eldre og immunkompromitterte populasjoner verden over ^12. Opptil 64 millioner rapporterte tilfeller av HRSV infeksjon og 160.000 dødsfall forekommer hvert år.

HRSV-genomet transkriberer 11 proteiner, inkludert tre membranproteiner F, G og små hydrofobe (SH). SH-protein er involverti patogenesen av RSV-infeksjon. RSV mangler SH-genet (RSVΔSH) var levedyktig, forårsaket dannelse av syncytia og vokste i tillegg til villtype (WT) virus ^13-16. Imidlertid RSVΔSH virus replikert 10 ganger mindre effektivt enn WT i de øvre luftveier ^{15, 16.} Også RSVΔSH viruset ble svekket i in vivo mus og sjimpanse-modeller ^{13, 17.}

SH-protein er en 64 (RSV undergruppe A) eller 65 (RSV undergruppe B) aminosyrer lang type II integrert membranprotein som akkumulerer hovedsakelig på membraner av Golgi-rommet ^18. SH protein har en enkelt spådd en-heliks trans (TM) domene ¹⁹ som er svært konservert ^20,21. De C- og N-terminale domener extramembrane er orientert lumenally / ekstracellulært og cytoplasmisk, respektivt.

Både syntetisk TM domene (rester 18-43) Og full lengde SH-protein har vist seg å danne homopentamers i en rekke forskjellige vaskemidler. Den homopentameric form er ansvarlig for kanalen aktivitet i planar lipidbilag ^22,23. Riktig orientering av TM monomerer i lipidbilaget ble først bestemt bruker nettstedet spesifikk infrarød dichroism ^23, som viste His-22 for å være i en lumenal, i nærheten av inter-heliks, orientering. Den samme TM-området orientering ble bekreftet ved NMR-studier som rekonstruert de penta a-spiralformet bunt av full-lengde proteinet i dodecylphosphocholine (DPC) miceller ^22. I denne 'micelle' modellen, ble et enkelt a- helisk TM domene flankert N-terminalt av en a-heliks, og C-terminalt med en utvidet b-hårnål. De to protonerbar rester av SH-protein, His-22 og His-51, er plassert i TM-området (lumenally orientert), og ved spissen av extramembrane C-terminale β hårnål (fjernt fra kanalen pore), henholdsvis. I en bicellar Environment imidlertid utvider TM α-heliks opp til His-51, og begge His-rester er tilgjengelige for lumen av kanalen ^24. Den kanalstruktur fatter en trakt-lignende arkitektur ^22, hvor den smalere område (Ser-29 til Cys-45) ²² er foret med hydrofobe sidekjeder (Ile-32, 36-Ile, Ile-Leu-40 og 44), og Ile-36 definerer det smaleste punktet i kanal lumen. Hans-22 er plassert på den største åpning av trakten, mens His-51 er på spissen av den minste åpning.

I det foreliggende papir, har analytisk sentrifugering i en sedimenteringslikevekt modus blitt brukt for å bestemme om sin protonering påvirker stabiliteten av SH-protein pentamer. I dette tilfelle ble SH-protein solubilisert i C14-betain vaskemiddel, som har blitt brukt tidligere for å vise at SH proteinformer pentamere ²² oligomerer.

Protocol

Denne protokollen er basert på følgende ressurser, som er å bli henvist for flere detaljer og spesielle hensyn 3, 25-28. 1. Tetthet matching av vaskemiddel miceller med 2 H 2 O Merk: Densiteten av bufferløsningen må være tilpasset til tettheten av vaskemiddel miceller. Vanlige tetthets-justerende midler omfatter to H 2 O, H 2 18 O 2 H 2 18 O, glycerol…

Representative Results

Den radiale fordelingsprofil C14SB vaskemiddel miceller i 50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7,3 danner et meget grunt eksponentialuttrykk som kan monteres på en lineær modell (Figur 7A). Skråningen av denne fordelingen er inverst korrelert til D 2 O konsentrasjon (figur 7B). Punktet hvor helningen er null, det vil si, den tilsvarende D 2 O-konsentrasjon, ble funnet å være 32,3%. Se figur 7 nedenfor. <p class=…

Discussion

Dette notatet gir en eksperimentell protokoll for prøveopparbeidelse og analyse av oligomerisering av en liten membran protein i vaskemiddel bruker likevekt sedimentering. Protokollen er beskrevet er like gyldig -og simpler- for løselige proteiner, som tettheten samsvarende trinnet ikke er nødvendig. Faktisk er det system som utgjøres av en blanding av detergent og protein. For å gjennomføre sedimenteringsstudier, må vaskemidlet være usynlig for gravitasjonsfeltet, slik at den ikke bidrar til partikkel flotasjon…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate	Sigma	T0807
Deuterium oxide 99.8%	Cambridge Isotope	DLM-4-99.8
An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place	Beckman Coulter	361964
Cell housing	Beckman Coulter	334784
12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled	Beckman Coulter	331376
Window holder	Beckman Coulter	305037
Window gasket	Beckman Coulter	327021
Window liner	Beckman Coulter	362329
Sapphire window	Beckman Coulter	307177
Quartz window	Beckman Coulter	301730
Screw-ring washer	Beckman Coulter	362328
Screw ring	Beckman Coulter	301922
Spinkote	Beckman Coulter	306812
Torque stand assembly	Beckman Coulter	361318
Counterbalance	Beckman Coulter	360219
Cell alignment tool	Beckman Coulter	362340
SEDNTERP			http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page
HeteroAnalysis			http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp
SEDFIT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm
SEDPHAT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm