A sedimentação de equilíbrio de uma proteína de membrana de formação de oligómero pequeno: Efeito de Histidina A protonação em pentamérica Estabilidade

Summary

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Abstract

Ultracentrifugação analítica (AUC) pode ser usado para estudar as interacções reversíveis entre macromoléculas sobre uma ampla gama de forças de interacção e em condições fisiológicas. Isso faz com que AUC um método de escolha para avaliar quantitativamente estequiometria e termodinâmica dos homo e hetero-associação que são transitórias e reversíveis nos processos bioquímicos. Na modalidade de equilíbrio de sedimentação (SE), um equilíbrio entre difusão e sedimentação fornece um perfil como uma função da distância radial que depende de um modelo de associação específica. Nisto, um protocolo detalhado SE é descrita para determinar a energia associação tamanho e monómero-monómero de uma pequena oligómero de proteína de membrana usando uma ultracentrífuga analítica. ES-AUC é livre de marcador, apenas com base em princípios físicos, e pode ser usado em ambas as proteínas solúveis da membrana e água. Um exemplo é mostrado deste último, o pequeno hidrofóbico (SH) nas proteínas do vírus sincicial respiratório humano (HRSV), Um polipeptídeo de ácido 65-amino com um único transmembranar (TM) de domínio helicoidal-α que forma canais de iões pentaméricos. Dados estrutural à base de RMN mostra que a proteína tem duas SH protonável resíduos de His no seu domínio transmembranar que são orientados de frente para o lúmen do canal. SE experimentos foram concebidos para determinar como pH afeta constante de associação e do tamanho da proteína oligomérica SH. Embora a forma pentamérica foi preservada em todos os casos, a sua constante de associação foi reduzida a pH baixo. Esses dados estão de acordo para uma dependência de pH semelhante ao observado para atividade canal SH, consistente com uma orientação do lúmen das duas Seus teor de resíduos no proteína SH. Este último pode experimentar repulsão eletrostática e estabilidade oligômero reduzida em pH baixo. Em resumo, este método é aplicável sempre que a informação quantitativa sobre proteína-proteína subtis alterações de associação em condições fisiológicas têm de ser medidos.

Introduction

Ultracentrifugação analítica ^1-5 é um dos métodos mais importantes para estudar as interações de macromoléculas em condições fisiológicas, sendo acessível para ambas as interações fracas e fortes. O método é livre-label e utiliza a absorção de luz ou interferência, e até mesmo sistemas ópticos de fluorescência pode ser usado para acessar faixas de concentração ao longo de várias ordens de magnitude ^6.

Este método é especialmente útil, pois a maioria dos processos bioquímicos dependem de interações reversíveis. A estequiometria e resistência destas interacções têm de ser quantitativamente caracterizada para compreender os processos biológicos, e um número de métodos existentes para este fim ^{7, 8.} No entanto, as interacções transientes são difíceis de estudar ^9.

A escolha de um método para caracterizar as interacções macromoleculares depende da sua natureza estática ou dinâmica. No primeiro caso, SEDIM entação velocidade (SV) é usada, em que a taxa de transporte radial é medida e complexos são fraccionados com base em diferenças na massa e forma flutuante.

Em contraste, as associações dinâmicas que são reversíveis na escala temporal da experiência não pode ser fisicamente separadas. Neste caso, auto ou hetero-interacções que as interacções não covalentes são em um equilíbrio que depende da concentração de proteína total. Estas interacções dinâmicas pode ser estudado por ambos equilíbrio de sedimentação (SE) e velocidade de sedimentação (SV) ^10. No entanto, o primeiro método é mais simples de realizar e é descrito aqui. Em SE, a centrifugação é realizada a uma velocidade suficientemente baixa de modo a que se atingir um equilíbrio entre difusão e sedimentação. Neste ponto, o perfil de equilíbrio de um sinal óptico (UV-VIS), como uma função da distância radial, pode ser analisada utilizando modelos termodinâmicos pré-definido para associações ^11.

ve_content "> No presente documento, um estudo de equilíbrio de sedimentação, é apresentado o auto-associação de uma proteína da membrana virai que forma canais de iões. Devido à sua hidrofobicidade, a experiência é executado em presença de detergentes, e no presente caso, a densidade de solvente tem de ser compensada com a do detergente. No entanto, o protocolo descrito seria idêntica no caso de uma proteína solúvel em água, excepto que sem correspondência de densidade solvente seria necessário.

A proteína utilizada é codificado no vírus respiratório sincicial humano (hRSV), um pneumovirus envelopado na família paramyxoviridae que causa a doença do trato respiratório inferior em crianças, idosos e imunocomprometidos populações em todo o mundo ^12. Até 64 milhões de casos notificados de infecção hRSV e 160.000 mortes ocorrem a cada ano.

O genoma hRSV transcreve 11 proteínas, incluindo as proteínas de membrana de três F, G, e pequeno hidrofóbico (SH). SH proteína está envolvidana patogênese da infecção pelo VSR. RSV sem o gene SH (RSVΔSH) era viável, causou a formação de sincícios e cresceu tão bem como o tipo selvagem (WT) vírus ^13-16. No entanto, o vírus RSVΔSH replicado 10 vezes menos eficientemente do que o WT no tracto respiratório superior ^{15, 16.} Além disso, o vírus RSVΔSH foi atenuada nos no rato vivo e modelos chimpanzé ^{13, 17.}

A proteína é um SH (RSV subgrupo A) 64 ou 65 (RSV subgrupo B) aminoácidos de comprimento do tipo II de proteína integral da membrana que se acumula maioritariamente nas membranas do Golgi compartimento ^18. SH proteína tem um único previu uma hélice transmembranar (TM) ¹⁹ de domínio que é altamente conservada ^20,21. Os domínios extramembrane C- e N-terminais são orientados lumenally / extracelularmente e no citoplasma, respectivamente.

Ambos domínio TM sintético (resíduos 18-43) E SH proteína de comprimento completo foram mostrados para formar homopentamers em uma variedade de detergentes. A forma homopentameric é responsável pela atividade do canal em bicamadas lipídicas planas ^22,23. A orientação correcta dos monómeros TM na bicamada lipídica foi primeiro determinada utilizando dicroismo local específico de infravermelhos ^23, o qual mostrou His-22 para estar em uma luminal, perto de inter-helicoidal, a orientação. O domínio TM mesma orientação foi confirmada por estudos de RMN que reconstituídas a pentamérica um feixe helicoidal da proteína de comprimento completo em dodecylphosphocholine (DPC) ²² micelas. Neste modelo 'micela', um único domínio TM a- helicoidal foi flanqueada no terminal-N por uma a-hélice, e C-terminal por uma b-gancho de cabelo estendida. Os dois resíduos de proteína protonáveis ​​SH, His-22 e His-51, estão localizados no domínio TM (orientada lumenally), e na extremidade do C-terminal extramembrane β hairpin (medida a partir da poro do canal), respectivamente. Em um ambie bicellarnment, no entanto, o TM α-hélice estende-se a His-51, e ambos os resíduos His são acessíveis para o lúmen do canal ^24. A estrutura do canal adopta uma arquitectura em forma de funil ^22, onde a região mais estreita (Ser-Cys-29 a 45) ²² está alinhada com cadeias laterais hidrofóbicas (Ile-32, Ile-36, Ile-40 e Leu-44), e Ile-36 define o ponto mais estreito no lúmen do canal. His-22 está localizado na maior abertura deste funil, enquanto que His-51 está na ponta de abertura mais pequena.

No presente documento, centrifugação analítica em equilíbrio de sedimentação de um modo foi usado para determinar se a sua protonação afecta a estabilidade do pentâmero da proteína de CS. Neste caso, SH proteína foi solubilizada em detergente de betaína-C14, que tem sido utilizado anteriormente para mostrar que as formas de proteínas pentaméricas oligómeros SH ^22.

Protocol

Este protocolo é baseado nos seguintes recursos, que devem ser encaminhados para mais detalhes e considerações especiais 3, 25-28. 1. Densidade de harmonização de micelas detergentes com 2 H2O Nota: A densidade da solução tampão deve ser adaptada à densidade das micelas detergentes. Agentes de ajuste de densidade comuns incluem 2 H 2 O, 2 H 18 O, 2 H 2 O <sup…

Representative Results

O perfil radial de distribuição C14SB micelas detergentes em Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,3, forma um exponenciais muito raso que poderiam ser ajustados a um modelo linear (Figura 7A). O declive desta distribuição está inversamente correlacionada com a concentração de D 2 O (Figura 7B). O ponto em que o declive é zero, ou seja, o correspondente D 2 O concentração, verificou-se ser de 32,3%. Veja a Figura 7 ab…

Discussion

Este documento fornece um protocolo experimental para a preparação e análise de oligomerização de uma pequena proteína de membrana em detergente usando equilíbrio sedimentação da amostra. O protocolo descrito é igualmente válido para -e simpler- proteínas solúveis, como o passo correspondente da densidade não é necessária. Com efeito, o sistema é constituído por uma mistura de detergente e da proteína. Para realizar estudos de sedimentação, o detergente deve estar invisível para o campo gravitacion…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate	Sigma	T0807
Deuterium oxide 99.8%	Cambridge Isotope	DLM-4-99.8
An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place	Beckman Coulter	361964
Cell housing	Beckman Coulter	334784
12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled	Beckman Coulter	331376
Window holder	Beckman Coulter	305037
Window gasket	Beckman Coulter	327021
Window liner	Beckman Coulter	362329
Sapphire window	Beckman Coulter	307177
Quartz window	Beckman Coulter	301730
Screw-ring washer	Beckman Coulter	362328
Screw ring	Beckman Coulter	301922
Spinkote	Beckman Coulter	306812
Torque stand assembly	Beckman Coulter	361318
Counterbalance	Beckman Coulter	360219
Cell alignment tool	Beckman Coulter	362340
SEDNTERP			http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page
HeteroAnalysis			http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp
SEDFIT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm
SEDPHAT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm