Küçük oligomer oluşturan Membran Protein Sedimantasyon Denge: pentameric İstikrar Histidine Protonasyon Etkisi
Summary
Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Abstract
Analitik ultrasantrifügasyon, (EAA) etkileşim kuvvetleri geniş bir aralıkta ve fizyolojik koşullar altında, makro moleküller arasındaki tersine çevrilebilir etkileşimler üzerinde çalışmak için de kullanılabilir. Bu AUC'sini nicel stoikiyometri ve homo ve biyokimyasal süreçlerde geçici ve geri dönüşümlüdür hetero-Dernek termodinamik değerlendirmek için bir seçim yöntemi yapar. Sedimantasyon denge yöntemi (SE) 'de, difüzyon ve çökelme arasında bir denge, belirli bir ilişki modeline bağlıdır radyal mesafenin bir fonksiyonu olarak, bir profil sağlar. Burada detaylı bir GD protokolü bir analitik ultrasantrifüj kullanarak küçük bir zar proteini oligomerin boyut ve monomer ilişki enerjisini tespit etmek üzere tarif edilmiştir. AUC-ES sadece fiziksel ilkelere dayalı, etiket-ücretsiz, ve hem suda çözünür ve membran proteinleri kullanılabilir. Bir örnek ikincisinin gösterilir, insan solunum sinsisyal virüsü küçük hidrofobik (SH) proteini (hRSV), Pentamerik iyon kanallarını oluşturan tek bir α-sarmal transmembran (TM) etki alanı ile 65-amino asit polipeptit. NMR tabanlı yapısal veriler SH proteini kanalının lümen bakan yönlendirilmiş olan zar ötesi etki protonlaştırılabilir iki His kalıntılarını sahip olduğunu göstermektedir. SE deneyleri pH dernek sabiti ve SH protein oligomerik boyutunu nasıl etkilediğini belirlemek için tasarlanmıştır. Pentamerik bir şekilde her durumda muhafaza ederken, bunun birleşme sabiti düşük pH değerinde indirgendi. Bu veriler, SH proteinde iki His tortularının bir lümene ilişkin yönlendirme ile tutarlı SH kanal aktivitesi için gözlenen benzer bir pH bağımlılığı ile uyum içindedir. ikincisi, düşük pH elektrostatik itme ve düşük oligomer istikrarı karşılaşabilirsiniz. Fizyolojik koşullarda ince, protein-protein ilişki değişiklikler hakkında niceliksel bilgi olarak ölçülmesi için her Özetle, bu yöntem uygulanabilir.
Introduction
Analitik Ultrasantrifügasyon 1-5, fizyolojik koşullar altında makromoleküllerin etkileşimleri incelemek zayıf ve güçlü etkileşimler hem erişilebilir olmasının en önemli yöntemlerden biridir. yöntem etiketi içermez ve ışık emiliminin veya girişim kullanır ve hatta floresan optik sistemler büyüklüğü 6 birkaç düzeyleri üzerinde konsantrasyon aralıkları ulaşmak için kullanılabilir.
En biyokimyasal işlemler tersine etkileşimine bağlıdır, bu yöntem özellikle faydalıdır. Bu etkileşimlerin stoikiometri ve gücü kantitatif biyolojik süreçleri anlamak için karakterize lazım, ve bir dizi yöntem, bu amaçla 7, 8 için var. Bununla birlikte, geçici etkileşimler 9 çalışma zordur.
makromoleküler etkileşimleri tanımlamak için bir yöntem seçimi statik veya dinamik doğasına bağlıdır. İlk durumda, Sedim yönelimi hızı (SV) radyal ulaşım oranı ölçülür ve kompleksleri yüzer kütle ve şekil farklılıkları esasında kesirleştirilmiştir yerlerde kullanılır.
Buna karşılık, deney zaman ölçeği üzerinde ters çevrilebilir dinamik dernekler fiziksel ayrılamaz. Bu durumda, kendi kendine ya da kovalent olmayan etkileşimlerin neden hetero etkileşimleri toplam protein konsantrasyonuna bağlı olan bir denge içindedir. Bu dinamik etkileşimler sedimantasyon denge (SE) ve sedimantasyon hızı (SV) 10 hem ele alınabilir. Bununla birlikte, birinci yöntem gerçekleştirmek için basit ve burada tarif edilmiştir. Bir denge difüzyon ve çökelme ile ulaşılır, böylece SE olarak, santrifüj, yeterince düşük bir hızda gerçekleştirilir. Bu noktada her iki radyal mesafenin bir fonksiyonu olarak, bir optik işaret (UV-VIS) denge profili, dernekler 11 için önceden belirlenmiş bir termodinamik modeller kullanılarak analiz edilebilir.
ve_content "> Bu yazıda, bir sedimentasyon dengeleme çalışması nedeniyle hidrofobisite. iyon kanallarını oluşturur viral zar proteininin kendi kendine birleşmeme özelliği sunulmuştur deney deterjan varlığında gerçekleştirilir, ve bu durumda yoğunluk olduğu Çözücü deterjan edilene uyumlu olması gerekir. Bununla birlikte, protokol solvent yoğunluk eşleme gerekli olacaktır, bunun dışında, suda çözünür protein halinde olur aynı tanımladı.kullanılan protein, insan solunum sinsisyal virüsü (hRSV), alt solunum yolu bebeklerde hastalığı, yaşlılar ve bağışıklık popülasyonları Dünya çapında 12 neden Paramyxoviridae ailesinden bir zarflı Pneumovirus kodlanmıştır. HRSV enfeksiyonu kadar 64 milyon bildirilen vaka ve ölüm 160,000 her yıl meydana gelir.
hRSV genom üç membran proteinleri, F, G ve küçük hidrofobik (SH) dahil olmak üzere 11 proteinleri transkripsiyonunu yapar. SH proteini katılırRSV enfeksiyonu patogenezinde. SH gen (RSVΔSH) eksik RSV mümkün olduğunu sinsitiyumların oluşmasına neden ve vahşi tip (WT) virüsü 13-16 kadar büyüdü. Bununla birlikte, RSVΔSH virüsü üst solunum yolu 15, 16 WT daha az verimli bir şekilde 10-kat çoğaltılır. Ayrıca, RSVΔSH virüs in vivo fare ve şempanze modelleri 13, 17 in zayıflatılmış oldu.
SH proteini 64 (RSV alt grup A) veya 65 (RSV alt grup B) amino asitler, uzun türü Golgi 18 zarlarına çoğunlukla birikir II integral membran proteinidir. SH proteini, tek bir yüksek 20,21 korunmuş bir sarmal transmembran (TM) etki 19 tahmin vardır. C- ve N-terminal extramembrane etki lumenally / hücre dışı ve sitoplazmik sırasıyla yönlendirilir.
Hem sentetik TM domeni (kalıntılar 18-43) Ve tam uzunlukta SH proteini deterjanların çeşitli homopentamers oluşturmak için gösterilmiştir. homopentameric bir şekilde düzlemsel bir lipid çift tabakaları 22,23 kanal aktivitesi için sorumludur. Lipit TM monomerlerin doğru yönlendirme ilk His-22, bir lümene ilişkin olması yakın yönde arası sarmal için gösterdi alana özel kızılötesi dikroizma 23 kullanılarak belirlenmiştir. Aynı TM domeni yönü (DPC) dodesilfosfokolin olarak pentamerik proteinin tam uzunluğunun bir sarmal demeti yeniden 22 miseller NMR çalışmaları ile teyit edilmiştir. Bu 'misel' modelinde, tek bir a-helis TM domeni bir genişletilmiş B-hairpin C-terminal a-helisin göre N-terminal olarak sınırlanan ve edilmiştir. SH proteininin iki protonize kalıntıları, His-22 ve His-51, TM domeni (lumenally yönelimli) bulunur ve extramembrane C-terminali β firketenin ucunda sırasıyla (kadar kanal gözeneğinden). Bir bicellar Çevreyinment, ancak TM α-heliks His-51 kadar uzanır ve her ikisi de His artığı kanalı 24 lümenine erişilebilir. 22 hidrofobik yan zincirler (Ile-32, Ile-36, Ile-40 ve Leu-44), ve kaplı olan kanal yapısı, bir huni benzeri bir mimari 22 dar bölümün benimser (Cys-45, Ser-29) Ile-36 kanal lümen dar noktasını tanımlar. His-51 küçük açıklığın ucunda ise His-22, bu huni büyük açıklık yer almaktadır.
Bu yazıda, bir sedimantasyon denge modunda analitik santrifüj O'nun protonlanma SH, protein pentamerin istikrar etkiler olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Bu durumda, SH protein, literatürde bu SH protein yapılarını pentamerik oligomerler 22 göstermek için daha önce kullanılmış olan C14-betain deterjan içinde çözünmüştür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, numune hazırlama ve denge sedimantasyon kullanılarak deterjan küçük bir zar proteini oligomerizasyon analizi için bir deney protokolü sağlar. yoğunluk eşleme aşaması gerekli değildir olarak açıklanan protokol, aynı derecede geçerlidir -ve çözünür proteinler için simpler- olup. Gerçekten de, deterjanlar ve proteinin bir karışımından teşekkül eder. Parçacık flotasyon katkıda bulunmaz, böylece sedimantasyon çalışmalar yapmak, deterjan yerçekimi alanına görünmez olmalı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
References
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. . Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions – Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- . . An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. . Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
