רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
זיהום שפעת קשור על 36,000 מקרי מוות ויותר מ -200,000 אשפוזים מדי שנה בארצות הברית. הופעתה המתמשכת של זני נגיף שפעת חדשים עקב מוטציה ומחדש מבחר מסבכת את השליטה של הנגיף ומחייבת פיתוח הקבוע של תרופות וחיסונים רומן. המחקר מבוסס המעבדה של שפעת דורש שיטה אמינה וחסכונית להתפשטות של הווירוס. כאן, פרוטוקול מקיף מסופק לשפעת התפשטות וירוס בביצי תרנגולת פורה, אשר מניבה באופן עקבי מניות נגיפיות גבוה כייל. בקיצור, ביצי סרום הפתוגן ללא (SPF) מופרה עוף טופחו על 37 מעלות צלזיוס ולחות% 55-60 במשך 10 – 11 ימים. במהלך תקופה זו, פיתוח עובר יכול להיות במעקב בקלות באמצעות קנדלר ביצה. חיסון וירוס מתבצע על ידי הזרקה של מניות וירוס לתוך חלל allantoic באמצעות מחט. אחרי 2 ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, הביציםמצונן לפחות 4 שעות על 4 מעלות צלזיוס. קליפת הביצה מעל שק האוויר וקרום chorioallantoic לאחר מכן פתחה בזהירות, ונוזל allantoic המכיל את הנגיף שנקטפו. הנוזל מנוקה מפסולת על ידי צנטריפוגה, aliquoted והועבר ל-80 ° C לאחסון לטווח ארוך. הכמות הגדולה (5-10 מיליליטר של נוזל לביצה המכיל וירוס) כייל נגיף וגבוה אשר בדרך כלל מושגת עם פרוטוקול זה הפכה את השימוש בביצים להכנת וירוס השיטה נוחה שלנו, בפרט ללימודים במבחנה הדורשים כמויות גדולות של וירוס שבמינונים גבוהים של אותו מניות הווירוס יש צורך.
Introduction
השפעת ממשיך להיות איום גדול לבריאות אדם. זוהי מחלה בדרכי הנשימה שעלול להיות הרסנית עם נטל גלובלי גדול גורם עד 500,000 מקרי המוות בעולם בשנה 1. נגיפי שפעת נמצאים במשפחת Orthomyxoviridae ולבצע RNA חד-גדילי 8 תחושה שלילית בגנום שלהם 1,2. הניוון הגבוה (כלומר "להיסחף", אנטיגני) של הגנום הנגיפי מונע חסינות לטווח ארוך. יתר על כן, השפעת היא עמידה יותר ויותר לתרופות אנטי-ויראליות 3.
מגיפת שפעת שפעת H1N1 2009 הדגישה את כל הנושאים המאתגרים הקשורים למחלת שפעת (זן מגפה, התנגדות אנטי-נגיפית, ייצור חיסון מתעכב). ניסוח החיסון נקבע מדי שנה על ידי ארגון הבריאות העולמית לזני שפעת הסביר ביותר פתוגניים (אחד עבור כל H1N1, H3N2 ושפעת B) 4. מכיוון ששיטה זו מבוססת על זן שפעת חזהים, זנים פתוגניים מעת לעת באופן שגוי שזוהו ויעילות חיסון יורדת באופן דרמטי. יתר על כן, את המראה של זני שפעת רומן יכול לעקוף תוכניות המניעות אלה גורמים למחל מגיפת 2.
יצירת חיסון נגד שפעת אוניברסלית כבר חמקמקה 5. לכן, מחקר חייב להמשיך להבנת הפתוגנזה של פציעת ריאות. למחקר במעבדה מתקן, במספר שיטות פותחו עבור בידוד וריבוי 6 ויראלי. יכולים להיות מוגברים נגיפי שפעת אנושיים במגוון רחב של מצעי תאים יונקים. עם זאת, וירוסים גבוה כייל יצירה בכמויות גדולות מושגות הטובות ביותר בביצי embryonated. הפרוטוקול הבא מתאר טכניקה לשפעת התפשטות וירוס ואחסון ממניות וירוס קיימות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שפעת גורמת לניטל עולמי גדול של מחלה, ועבודה נמשכת להבנת הפתוגנזה של פציעת ריאות 7. למחקר הקל במחלה קטלנית, שיטות שונות פותחו כדי להפיץ את נגיף שפעת 6. כאן אנו מתארים טכניקה לייצר וירוס שפעת בביצי תרנגולת. היתרון של שיטה זו הוא שזה מאוד לשחזור ותוצאות בכמויות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza — United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
