Использование аденоассоциированные Касперского как инструмент для изучения сетчатки барьеров при болезни
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
Müller клетки являются основными глиальные клетки сетчатки. Их конечные ноги образуют границы сетчатки на наружной и внутренней мембран, ограничивающих (ILM), так и в сочетании с астроцитов, перицитов и эндотелиальных клеток, они устанавливают крови сетчатки барьер (BRB). BRB ограничивает перемещение материала между кровоток и сетчатке, а ILM выступает в качестве базальной мембраны, которая определяет гистологически границу между сетчаткой и полость стекловидного тела. Маркировка Мюллера клетки особенно актуальным изучение физического состояния сетчатки барьеров, так как эти клетки являются неотъемлемой частью BRB и ILM. Оба белорусских рублей и ILM часто изменяется в болезни сетчатки и отвечают за симптомов заболевания.
Есть несколько хорошо зарекомендовавших себя методов исследования целостности BRB, такие как Эванс голубой анализа или флуоресцентной ангиографии. Однако эти методы не дают информации о степени BRB проницаемости тО более крупных молекул, в нанометровом диапазоне. Кроме того, они не предоставляют информацию о состоянии других сетчатки барьерами, такими как ILM. Для изучения Brb проницаемость наряду сетчатки ILM, мы использовали метод, основанный AAV, который предоставляет информацию о проницаемости BRB к более крупных молекул, указывая при этом на состояние ILM и белков внеклеточного матрикса в болезненных состояний. Два варианта AAV полезны для такого исследования: AAV5 и ShH10. AAV5 имеет естественную тропизм к фоторецепторов, но он не может донести до внешней сетчатки при введении в стекловидное тело, когда ILM нетронутыми (т.е. в сетчатке дикого типа). ShH10 имеет сильную тропизм к глиальных клеток и выборочно пометить Клетки Мюллера как у здоровых и больных сетчатки. ShH10 обеспечивает более эффективную доставку генов в сетчатке, где ILM находится под угрозой. Эти вирусные инструменты в сочетании с иммуногистохимии и крови Анализ ДНК пролить свет на состояние сетчатки барьеров в болезни.
Introduction
Müller клетки являются основным компонентом глиальных сетчатки. Морфологически они охватывают сетчатки радиально и их endfeet, в контакте с стекловидное тело, сталкиваются с ILM и секретные компоненты последнего. ILM является базальная мембрана состоит из около десяти различных белков внеклеточного матрикса (ламинином, агрин, перлекан, нидоген, коллагеновых и несколько гепарин сульфат протеогликаны). Во время разработки, ее присутствие является необходимым условием для сетчатки гистогенеза, навигации оптических аксонов, и выживание клеток ганглиев 1-3. Тем не менее, ILM необязательно во взрослой сетчатке и может быть удалена хирургическим путем в некоторых патологий, не вызывая повреждения сетчатки 4. В генной терапии, эта мембрана становится физический барьер для эффективного трансдукции сетчатки с использованием AAVs путем инъекции в стекловидное тело 5.
Через обширный разветвление процессов их, Мюллер клетки обеспечивают питательную и нормативно-SuppoРТ оба нейроны сетчатки и сосудистой клетки. Мюллер клетки также участвуют в регуляции сетчатки гомеостаза, в формировании и поддержании BRB 6. Плотные соединения между сетчатки эндотелиальных клеток капилляров, Мюллер клетки, астроциты и перициты образуют BRB. BRB предотвращает некоторые вещества из ввода retina.In многих заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, окклюзии вены сетчатки и респираторных заболеваний, гипоксия сетчатки вызывает утечки через BRB 7-9. Этот разрыв связан с увеличением проницаемости сосудов, ведущих к вазогенного отека, отслойки сетчатки и повреждения сетчатки.
Мюллер клетки тесно ассоциированы с кровеносными сосудами и базальной мембраны, играет важную роль как в BRB и ILM целостности. Следовательно, называя Мюллера глиальные клетки, в частности, отношение к изучению физического состояния этих сетчатки барьеров.
Классическийсоюзник, BRB проницаемость измеряется с помощью Evans Blue анализа, состоящий из системной инъекции синего красителя Эванса, который связывается нековалентно альбумина плазмы. Этот анализ измеряет утечку альбумина (белка промежуточного размера, ~ 66 кДа) из кровеносных сосудов в сетчатке (см Протоколы раздел 5) 10. Кроме того, сосудистой утечки могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной сетчатки ангиографии, подтверждающего наличие утечек флуоресцеина (малой молекулы, ~ 359 Да, см Протоколы раздел 6) 11. Тем не менее, оба метода позволяют оценить BRB проницаемости для малых молекул и белков, но они не дают информации о целостности ILM.
Таким образом, для изучения Brb проницаемость, мы использовали метод, основанный AAV, который дает информацию о BRB проницаемости для больших молекул (например, частиц AAV, диаметр 25 нм). Частицы Действительно, наш метод может обнаружить присутствие AAV трансгена в крови, которые бы предположить, что ~ 25 нм в диаметре быбыть в состоянии проникнуть в кровь. Этот метод также дает информацию о структуре ILM и белков внеклеточного матрикса при патологических состояниях. Два варианта AAV полезны для такого исследования: AAV5 и ShH10. Subretinally инъекций, AAV5 имеет естественную тропизм к фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки 12, но он не может донести до внешней сетчатки при введении в стекловидное тело в сетчатке дикого типа с неповрежденной ILM 5,13. ShH10 является AAV вариант, который был разработан специально для целевой глиальные клетки более нейронов 14,15. ShH10 выборочно этикетки Мюллер клеток в здоровых и больных сетчатки с повышением эффективности сетчатки с ослабленной барьеров 16. Эти вирусные инструменты в сочетании с immuhistochemistry и анализа крови ДНК предоставить информацию о состоянии сетчатки барьеров и их участия в болезни (рис 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
BRB регулирует обмен молекулами между кровью и сетчаткой. Его пробой, связанный с различными заболеваниями, такими как диабетическая ретинопатия или возрастной макулярной дегенерации (ВМД). Мы недавно показали, что в дистрофина нокаут-мыши, который отображает проницаемой BRB, сетчатка ст…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
