Met behulp van adeno-geassocieerd virus als een instrument om retinale Barrières in ziekte te bestuderen
Summary
To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.
Abstract
Müller cellen zijn de belangrijkste gliale cellen van de retina. Hun end feet vormen de grenzen van het netvlies aan de buitenste en binnenste beperkende membranen (ILM), en in samenhang met astrocyten, pericyten en endotheliale cellen daarin voor de bloed-retina barrière (BRB). BRB beperkt materiaaltransport tussen de bloedstroom en het netvlies tijdens de ILM fungeert als een basaalmembraan die histologisch definieert de grens tussen het netvlies en het glasachtige holte. Labelen Müller cellen is bijzonder relevant voor de fysieke toestand van het netvlies barrières te bestuderen, omdat deze cellen zijn een integraal onderdeel van de BRB en ILM. Zowel BRB en ILM worden vaak veranderd bij ziekte van het netvlies en zijn verantwoordelijk voor de symptomen van de ziekte.
Er zijn verschillende goed gevestigde werkwijzen om de integriteit van de BRB bestuderen, zoals Evans blue assay of fluoresceïne angiografie. Maar deze methoden geven geen informatie over de mate van BRB permeabiliteit to grotere moleculen, in het nanometer bereik. Bovendien hoeven zij geen informatie over de toestand van andere retinale barrières zoals de ILM. Om BRB permeabiliteit te bestuderen naast retinale ILM, gebruikten we een AAV gebaseerde methode met informatie over doorlaatbaarheid van BRB tot grotere moleculen terwijl die de status van de ILM en extracellulaire matrixeiwitten ziektetoestanden. Twee AAV varianten zijn nuttig voor een dergelijke studie: AAV5 en ShH10. AAV5 een natuurlijk tropisme voor fotoreceptoren, maar het kan niet over naar de buitenste retina bij toediening in het glaslichaam bij de ILM intact (dwz in wildtype retina). ShH10 heeft een sterke tropism richting gliacellen en zal selectief Müller glia labelen bij zowel gezonde als zieke netvliezen. ShH10 biedt efficiëntere genaflevering in netvlies waar ILM in het gedrang komt. Deze virale gereedschap in combinatie met immunohistochemie en bloed-DNA-analyse licht werpen op de toestand van het netvlies barrières bij de ziekte.
Introduction
Müller cellen zijn de belangrijkste gliale component van het netvlies. Morfologisch weerszijden van de retina radiaal en hun eindvoetjes van astrocyten in contact met het glasachtige lichaam, het gezicht van de ILM en geheime componenten van de laatstgenoemde. De ILM is een basaal membraan samengesteld uit een tiental verschillende extracellulaire matrix eiwitten (laminin, agrine, perlecan, nidogen, collageen en verscheidene heparinesulfaat proteoglycanen). Tijdens de ontwikkeling, haar aanwezigheid is onmisbaar voor het netvlies histogenese, navigatie van optische axonen, en overleving van ganglioncellen 1-3. Echter, ILM is onwezenlijke bij volwassen netvlies en kan operatief verwijderd worden in bepaalde pathologieën zonder dat er schade aan het netvlies 4. Bij gentherapie, dit membraan wordt een fysieke barrière voor efficiënte transductie van het netvlies met AAV door intravitreale injectie 5.
Door de uitgebreide arborization van hun processen, Müller cellen voedings- en regelgeving Support zowel retinale neuronen en vasculaire cellen. Müllercellen zijn ook betrokken bij de regulatie van de retinale homeostase, bij de vorming en instandhouding van de BRB 6. Krappe kruispunten tussen retinale capillaire endotheelcellen, Müller cellen, astrocyten en pericyten vormen de BRB. BRB voorkomt dat bepaalde stoffen uit het invoeren van de retina.In vele ziekten zoals diabetische retinopathie, retinale veneuze occlusie en aandoeningen van de luchtwegen, hypoxie van het netvlies veroorzaakt lekkage door de BRB 7-9. Deze breuk wordt geassocieerd met een verhoogde vasculaire permeabiliteit leidt tot vasogeen oedeem, retinale loslating en schade aan het netvlies.
Müllercellen zijn sterk geassocieerd met bloedvaten en de basale membraan, speelt een belangrijke rol in zowel BRB en ILM integriteit. Bijgevolg labelen Müller gliacellen is bijzonder relevant voor de studie van de fysische toestand van deze retina barrières.
Klassiekbondgenoot, wordt BRB doorlatendheid gemeten met de Evans blauw test bestaat uit systemische injectie van Evans blauwe kleurstof, die niet-covalent bindt aan plasma-albumine. Deze test meet de albumine lekkage (eiwit van tussenmaat, ~ 66 kDa) van de bloedvaten in het netvlies (zie protocollen hoofdstuk 5) 10. Als alternatief kan de vasculaire lekkage worden gevisualiseerd door fluorescentie retinale angiografie procedures voor de lekkage van fluoresceïne (kleine molecule, ~ 359 Da; zie Protocollen hoofdstuk 6) 11. Toch beide methoden is het mogelijk de evaluatie van de BRB permeabiliteit voor kleine moleculen en eiwitten, maar ze hebben geen informatie over de ILM integriteit.
Vandaar dat BRB permeabiliteit onderzoeken gebruikten we een AAV gebaseerde methode die informatie over de BRB permeabiliteit voor grotere moleculen (bijvoorbeeld AAV deeltjes 25 nm diameter) geeft. Inderdaad, kan onze methode aanwezigheid van AAV transgen op te sporen in het bloed, wat zou suggereren dat ~ deeltjes 25 nm diameter zoukunnen infiltreren in de bloedbaan. Deze werkwijze geeft ook informatie over de structuur van de ILM en extracellulaire matrixeiwitten in pathologische omstandigheden. Twee AAV varianten zijn nuttig voor een dergelijke studie: AAV5 en ShH10. Subretinally geïnjecteerd, AAV5 een natuurlijk tropisme voor fotoreceptoren en retinale pigmentepitheel 12 maar het kan niet over naar de buitenste retina bij toediening in het glaslichaam in wildtype retina's met intacte ILM 5,13. ShH10 een AAV variant die is ontworpen om specifiek te richten gliale cellen over neuronen 14,15. ShH10 etiketten selectief Müller cellen bij zowel gezonde als zieke netvliezen met een verhoogde efficiëntie in het netvlies met een gecompromitteerde barrières 16. Deze virale gereedschap in combinatie met immuhistochemistry en bloed-DNA-analyse geven informatie over de toestand van het netvlies barrières en hun betrokkenheid bij de ziekte (figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
De BRB regelt de uitwisseling van moleculen tussen bloed en retina. De verdeling wordt geassocieerd met verschillende ziekten zoals diabetische retinopathie of leeftijd gerelateerde maculaire degeneratie (AMD). We hebben onlangs aangetoond dat in een dystrofine knock-out muis, die permeabel BRB weergeeft, het netvlies toleranter voor genoverdracht gemedieerd door adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV). Ondanks BRB permeabiliteit AAV deeltjes geïnjecteerd intraoculair beperkt blijven tot de oculaire compartimenten in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and Mélissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to Stéphane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0,5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium Citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight – 8,5cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| Micro-ciseaux de Vannas courbe | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
